本发明属于病原微生物及其核酸的快速检测。具体而言，涉及一种借助crispr/cas12a系统对b族链球菌(gbs)进行快速且精准的识别和检测的方法。
背景技术：
1、b族链球菌(group b streptococcus，gbs)，亦称为无乳链球菌，属于革兰氏阳性β溶血链球菌，通常寄生于女性的阴道和胃肠道内。作为条件致病菌，gbs在一般健康人群并不引发疾病。然而，当孕妇受到gbs感染时，存在通过分娩过程将细菌垂直传播给新生儿的风险。据估计，新生儿感染gbs的概率大约介于1％～2％，这可能导致严重的局部感染和全身性，从而引发新生儿肺炎、败血症和脑膜炎等严重疾病。鉴于此，针对孕妇的gbs检测和随后实施预防性干预对于降低新生儿感染及其并发症的风险至关重要。西方发达国家如美国和欧洲国家普遍推荐实施采取产前gbs筛查与分娩期间使用抗生素的预防措施。不过，关于筛查时机的选择上存在差异：美国疾病控制中心(cdc)推荐在35-37孕周进行gbs培养普筛，而欧盟共识则倾向于临产时采用快速gbs检测技术。
2、在我国2021年出台的《预防围产期b族链球菌(中国)专家共识》中，提出了对孕35至37周孕妇进行gbs筛查的建议。该共识中推荐的实验室检测方法为：首先利用选择性增菌培养基的肉汤培养基进行增菌培养，之后将培养物接种到血琼脂培养基上继续培养。接着，通过乳胶凝集试验、显色培养基法、dna探针技术或核酸扩增实验(nucleicacidamplification testing,naat)等先进技术手段，对gbs进行准确的鉴定和检测。当前，在临床上应用的gbs检测方法均存在一定的局限性。传统的细菌培养法，作为gbs检测的经典方法和手段,受限于检测原理，其检测特异性不佳。此外，该方法需要18～24h的培养时间才能观察到结果，并且对于低浓度菌量检出更是困难。同时，微生物学培养法在临床检测中往往伴随着较高的假阳性率和假阴性率。基于抗原检测的乳胶凝集法和胶体金免疫层析法，则面临灵敏度和特异性不足的挑战。尽管qpcr等核酸检测技术以其高灵敏度、优良的特异性、良好的重复性以及快速安全的特点，逐步成为孕妇gbs感染检测的主要手段，但其依赖于昂贵的qpcr扩增仪和需由专业技术人员操作，限制了其在基层医疗单位和家庭的普及和应用。因此，开发一种既能够在中心实验室筛查，又适合床旁检测(point-of-care-testing,poct)的简易、快捷且高灵敏的检测方法，是gbs核酸检测未来的发展方向。
3、规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，crispr)是在古细菌中发现的一种天然免疫防御机制。crispr-cas12a是crispr系统中的一种重要类型，仅需要crrna就能精确地靶向其底物。它不仅具备特异性切割双链dna的顺式活性，还能在识别到目标基因后获得反式活性而非特异性地降解单链dna。这种反式活性的触发为cas12a提供了一种强大的核酸检测潜能。crrna的靶向特异性以及顺、反式活性的触发是cas12a应用于核酸检测的关键所在。crrna由发夹结构及与双链核酸互补的一段核苷酸构成。通常情况下互补序列越长crrna的切割活性越好，互补序列较短crrna识别特异性越好，但短的crrna可能会导致活性的丧失。此外，发夹结构后的4-5个碱基对rna活性影响较大，若核酸在此位置出现突变将无法激活切割活性。因此设计合理、保守的rna序列是保证检测效果的前提。
4、近来，国内外学者主要将荧光检测系统与crispr/cas12a技术相融合，以开发新型的gbs检测方法。这些方法在应用于临床样本检测时，展现出了较好的性能表现。然而，这一检测系统通常依赖于高成本且需要专业操作技能的荧光检测设备，这在一定程度上限制了它的广泛应用。此外，yu等人利用g4链体技术结合crispr/cas12a，成功实现了对gbs的裸眼可视化检测。尽管这种方法为gbs检测提供了一种无需复杂仪器的解决方案，但直接的视觉判读结果可能会受到环境条件和主观判断的影响，从而影响检测结果的准确性和可重复性。考虑到围产期gbs筛查和防治监测的重要性，以及孕妇身体状况和医患配比的实际限制，gbs的检测不仅需要具备高度的准确性和灵敏度，还应该能够在专业实验室外的基层医疗机构乃至家庭环境中进行。然而，现有的基于crispr/cas12a的gbs检测方法在这些环境中仍面临使用限制，特别是缺乏专业光学设备的情况下。
技术实现思路
1、本发明旨在解决现有gbs筛查、监测和预防控制技术所面临的局限和不足之处，从而提供一种具有高灵敏度和高特异性的检测方法。该方法操作简单、检测快速且能够准确地检测gbs。进一步地，本方法还支持对检测结果进行数字化分析，并提供了一种基于移动智能终端的结果输出与数据管理的系统化解决方案。本发明建立的检测方法不仅适用于专业检测机构，还适合基层医疗机构乃至家庭等多种环境中的孕妇产前检测，无需昂贵的仪器设备和专业的实验室条件，对孕妇围产期gbs感染的检测与防治具有重要意义。
2、本发明的目的是提供一种检测效果理想、灵敏度准度高的用于gbs检测的crrna。
3、本发明的再一目的是提供所述crrna在检测b族链球菌中的应用。
4、本发明的再一目的是提供所述crrna在制备b族链球菌检测试剂中的应用。
5、本发明的再一目的是提供一种基于crispr/cas12a检测b族链球菌的检测系统，包括所述crrna、era扩增引物对以及被标记的单链dna探针。
6、优选的，所述era扩增引物对era-f和era-r，核酸序列如seq id no2、3所示。
7、本发明所述检测系统为可以荧光检测系统，所述单链dna探针被荧光基团和淬灭基团标记。
8、一个具体的示例，所述被标记的单链dna探针为5’-fam-ttatt-bhq1-3’。
9、本发明所述检测系统可以为侧向流层析检测系统，所述单链dna探针被荧光基团和生物素基团标记。
10、一个具体的示例，所述被标记的单链dna探针为5’-fam-ttatt-bio-3’。
11、所述侧向流层析检测系统还包括检测被标记的单链dna探针完整性的胶体金侧向流层析载体。所述侧向流层析检测系统还可以整合智能移动终端，包括用于胶体金侧向流层析卡读取和数据分析的小型化便携设备、用于数据分析结果回传和管理的智能移动终端应用小程序等。
12、本发明的另一目的是提供一种检测gbs的crispr/cas12a系统。
13、本发明的再一目的是提供一种基于crispr/cas12a快速精准检测gbs的荧光检测方法。
14、本发明的再一目的是提供一种基于crispr/cas12a快速精准检测gbs的侧向流层析试纸检测方法。
15、本发明的再一目的是提供一种基于crispr/cas12a快速精准检测gbs的整合智能移动终端的侧向流层析检测方法。
16、本发明的再一目的是提供一种基于crispr/cas12a快速精准检测gbs的荧光检测试剂盒。
17、本发明的再一目的是提供一种基于crispr/cas12a快速精准检测gbs的侧向流层析试纸条及检测卡。
18、本发明的再一目的是提供一种基于crispr/cas12a快速精准检测gbs的侧向流层析试纸条智能移动终端数字分析、结果输出与数据管理的系统化解决方案。
19、本发明上述目的通过以下技术方案实现：
20、本发明研究发现，当gbs核酸与cas12a、crrna形成三元复合物时，该复合物中cas12a的ruvc结构域行使dnase活性，切割带有荧光试剂和淬灭基团标记的单链dna探针，通过检测荧光恢复即可得知待检样品中是否含有gbs核酸。同理，当标记有荧光试剂和生物素的单链dna探针被激活的cas12a切割后，可通过侧向流层析试纸得出检测结果。在此基础上，本技术包括的便携式侧向流层析试纸读取器能够准确地捕获特定型号试纸卡上的质控线(c线)和检测线(t线)的光学信号，并与云端服务器中预先建立的不同批次试纸卡性能参数进行比对，进而利用检测线与质控线的灰度值比(t/c)来计算和分析出gbs的检测结果。计算完成后，检测结果将通过一个专门设计的应用小程序回传并保存在用户的智能移动设备上(如图1所示)。基于此，本发明建立了一种基于crispr/cas12a的快速精准检测b族链球菌的方法，该方法包含了荧光检测、侧向流层析检测和智能移动终端数字化检测等三个系统。设计了精准度高、检出效率高、灵敏度高的优质crrna，保证了gbs检测效果。
21、因此，本发明提供一种用于b族链球菌检测crrna，核苷酸序列如seq id no：1所示。
22、所述crrna在检测b族链球菌中的应用，以及在制备gbs检测试剂中的应用，也均在本发明的保护范围之内。
23、基于此还提供一种检测b族链球菌的crispr/cas12a系统，包括上述crrna、era扩增引物对以及被标记的单链dna探针。
24、优选的，所述era扩增引物对era-f和era-r，核酸序列如seq id no：3、4所示。
25、本发明所述检测系统为可以荧光检测系统，所述单链dna探针被荧光基团和淬灭基团标记。
26、一个具体的示例，所述被标记的单链dna探针为5’-fam-ttatt-bhq1-3’。
27、本发明所述检测系统可以为侧向流层析检测系统，所述单链dna探针被荧光基团和生物素基团标记。
28、一个具体的示例，所述被标记的单链dna探针为5’-fam-ttatt-bio-3’。
29、所述侧向流层析检测系统还包括检测被标记的单链dna探针完整性的胶体金侧向流层析载体。所述侧向流层析检测系统还可以整合智能移动终端，包括用于胶体金侧向流层析卡读取和数据分析的小型化便携设备、用于数据分析结果回传和管理的智能移动终端应用小程序等。
30、另外，所述crispr/cas12a系统还包括era扩增体系和crispr/cas12a检测体系所需试剂。
31、具体地，作为一种可选择的方案，所述era扩增体系如下：
32、
33、
34、所述crispr/cas12a检测体系如下：
35、
36、此外，基于上述技术成果，本发明还涵盖了gbs检测试剂盒和相关产品，它包含了所述crispr/cas12a系统以及三种相应的配套检测方案。这些方案利用crispr/cas12a系统实现了对gbs的快速而准确检测。同时，本发明还涉及基于crispr/cas12a检测原理构建的gbs检测侧向流试纸条和试纸卡，以及一套相应的基于移动智能设备的数据采集、分析及检测结果回传与管理的数字化系统方案及其工作原理。所有这些组成部分和技术方案均属于本发明的保护范围。
37、本发明具有以下有益效果：
38、本发明首次研究提供了一种基于crispr/cas12a能够快速、精准检测gbs核酸技术，这种技术包括荧光检测、侧向流试纸检测及结合智能移动终端的结果分析均可作为孕妇围产期检测gbs感染的方法。其最大的优势在于适合多场景使用。荧光检测系统适用于医疗机构普筛gbs感染，试纸检测系统适用于基层医疗机构进行产前快速诊断。而智能移动终端数字化检测系统为基层医疗机构和个人居家检测提供优良的检测方案，同时为基层医疗数据建档和个人诊疗记录追踪奠定基础。
39、本发明建立的检测方法的另一优势为，基于crispr/cas12a的荧光及试纸检测系统灵敏度高，可检测到1copy/μl的细菌基因组或3000cfu/ml的细菌样本。相较于核酸检测的“金标准”荧光定量pcr，检测仪器简单，成本低，无需专业实验室条件。
40、本发明建立的检测方法的再一优势为，基于crispr/cas12a的侧向流层析试纸检测系统可实现可视化检测判读。无需仪器辅助，肉眼直接观察t线与c线的颜色变化得出检测结果。
41、本发明建立的检测方法的再一优势为，侧向流层析试纸检测系统搭配微型光信号检测仪可实现智能移动终端数据分析与储存，排除人为误差及环境干扰。
42、本发明建立的检测方法的再一优势为筛选到效果好的检测位点，使本发明建立的检测方法的特异性和灵敏度进一步提升。
43、本发明建立的检测方法的再一优势为筛选到效果好的crrna，使本发明建立的检测方法灵敏度进一步提高。
44、本发明建立的检测方法的再一优势检测时间短，基于crispr/cas12a的两种检测系统均只需40-50min即可得出检测结果。故本发明建立的检测方法更有利于临床产前快速检测gbs。
1.一种用于b族链球菌检测的crrna，其特征在于，核苷酸序列如seq id no：1所示。
2.权利要求1所述crrna在检测b族链球菌中的应用。
3.权利要求1所述crrna在制备b族链球菌检测试剂中的应用。
4.一种基于crispr/cas12a检测b族链球菌的检测系统，其特征在于包括权利要求1所述crrna、era扩增引物对以及被标记的单链dna探针。
5.根据权利要求4所述的检测系统，其特征在于所述era扩增引物对era-f和era-r，核酸序列如seq id no3、4所示。
6.根据权利要求4所述的检测系统，其特征在于所述检测系统为荧光检测系统，所述单链dna探针被荧光基团和淬灭基团标记。
7.根据权利要求6所述的检测系统，其特征在于所述被标记的单链dna探针为5’-fam-ttatt-bhq1-3’。
8.根据权利要求4所述的检测系统，其特征在于所述检测系统为侧向流层析检测系统，所述单链dna探针被荧光基团和生物素基团标记。
9.根据权利要求8所述的检测系统，其特征在于所述被标记的单链dna探针为5’-fam-ttatt-bio-3’。
10.根据权利要求8所述的检测系统，其特征在于，还包括检测被标记的单链dna探针完整性的胶体金侧向流层析载体。
