本发明属于基因工程，具体涉及雷斯青霉高效制备氢化可的松菌种的构建及应用。
背景技术：
1、氢化可的松(hydrocortisone，hc)是一种重要的糖皮质激素，也是合成其他糖皮质激素药物的重要中间体，在临床主要应用于胶原性疾病，红斑狼疮，风湿性关节炎的治疗。
2、工业上主要利用蓝色犁头霉(absidia coerulea)以11-脱氧皮质甾醇-21-醋酸酯(rsa)作为其转化的底物，先将rsa转化为11-脱氧皮质甾醇(rs)，其次在c11β位引入羟基合成氢化可的松，转化过程为图1。由于蓝色犁头霉羟化专一性较差，副产物多，因此寻找c11β-羟化酶基因新的表达宿主，以期获得高效生产氢化可的松的重组菌株。
3、目前常用酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)作为c11β-羟化酶基因的表达宿主，该方法在酶分子改造中具有易进行基因操作、易筛选等优势，但在制备氢化可的松的过程中依然存在投料量低，转化速率较慢等缺点。相比之下，雷斯青霉(penicilliumraistrickii)atcc 10490本身具有良好的甾体转化能力，经crispr-cas9基因编辑技术改造后更适合作为c11β-羟化酶基因宿主。
技术实现思路
1、实验室前期构建的具有高羟化特异性的c11β-羟化酶基因突变体cyp5311b2e232d为构建新型高效生产氢化可的松的雷斯青霉重组菌提供了基因资源。
2、本发明的技术路线如下：本发明通过crispr-cas9编辑将c11β-羟化酶基因cyp5311b2e232d替换雷斯青霉中c15α-羟化酶基因prh，获得了一种工业高效制备氢化可的松的雷斯青霉重组菌，为c11β-羟化工艺提供了借鉴。利用crispr-cas9基因编辑技术获得c11β-羟化霉基因cyp5311b2雷斯青霉重组宿主菌步骤如下：
3、(1)确定cas9靶向的prh基因序列；
4、(2)构建含有ama1序列、两个grna表达盒、一个cas9表达盒的表达载体plm1-grna-1-2-cas9；
5、(3)将(2)中重组表达载体利用原生质体转化法化转入野生雷斯青霉进行基因编辑；
6、(4)获得的转化子提取基因组进行测序验证，得到c15β-羟化酶基因prh失活的雷斯青霉宿主菌；
7、(5)转化子转接至无抗pda试管中培养至产生孢子，利用灭菌ddh2o洗涤霉菌孢子，稀释涂板；
8、(6)菌落长出后，将菌落同时依次对点至潮霉素b 300mg/ml及无抗pda平板筛选得到c15β-羟化酶基因prh缺失且丢掉plm1-grna-1-2-cas9载体的雷斯青霉宿主菌。
9、(7)构建目标基因表达载体pblue-paoh-cyp5311b2 e232d。
10、(8)将(7)中表达载体pblue-paoh-cyp5311b2 e232d利用原生质体转化法化转入c15β-羟化酶基因prh失活的雷斯青霉得到重组菌株。
11、本发明所述的蓝色犁头霉c11β-羟化酶突变体基因cyp5311b2 e232d的核苷酸序列如seq id no.1所示，以上序列属于本发明保护范围。
12、利用本发明所述的编码c11β-羟化酶的基因片段cyp5311b2 e232d所构建的重组表达载体、重组表达质粒或宿主细胞也属于本发明的保护范围，所使用的扩增引物序列也属于本发明的保护范围。
13、本发明所述采用半理性设计和定点突变技术获得的突变体基因cyp5311b2 e232d编码的甾体化合物羟化酶包括但不限于酿酒酵母、毕赤酵母、蓝色犁头霉、雷斯青霉等宿主细胞内表达。
14、有益效果：本发明利用crispr-cas9基因编辑技术对野生雷斯青霉进行改造，获得了c15α-羟化酶基因prh失活的雷斯青霉宿主菌，再通过crispr-cas9技术得到高效制备氢化可的松的重组雷斯青霉。重组雷斯青霉羟化特异性提高且投料量达3.5g/l，产物氢化可的松的得率达到78％。本发明研究成果具有很好的工业应用价值。
1.甾体11β-羟化酶突变体cyp5311b2 e232d其特征在于，所述突变体氨基酸序列是在来源于蓝色犁头霉甾体11β-羟化酶基因cyp5311b2的序列上进行突变，即突变体232位氨基酸由谷氨酸变成天冬氨酸，其序列seq id no：1所示。
2.一株重组雷斯青霉，其特征在于，利用crispr-cas9技术获得删除了甾体15α-羟化酶基因的雷斯青霉菌株，并将seq id no：1所示的cyp5311b2 e232d突变体核苷酸序列构建在含有ama1序列的质粒表达载体上，通过原生质体转化的方式在雷斯青霉底盘菌株中表达，获得高效制备氢化可的松的重组雷斯青霉菌株。
3.根据权利要求1所述的重组雷斯青霉菌株，其特征在于重组雷斯青霉菌可催化底物11-脱氧皮质甾醇-21-醋酸酯生成氢化可的松，总投料量为3.5g/l。
