本发明属于生物，涉及一种制备car-t细胞的方法，尤其是涉及一种使用间充质干细胞来源的工程化外泌体介导mrna快速生成car-t细胞的方法。
背景技术：
1、近年来，癌症作为全球主要的死亡原因之一，其发病率和死亡率呈现逐年上升的趋势。根据全球癌症观察(global cancer observatory)的数据显示，2020年全球新增癌症病例约为1930万例，死亡病例约为1000万例。随着人口老龄化、环境污染和生活方式改变，癌症的负担日益加重，成为全球公共卫生领域的重大挑战。传统的癌症治疗手段主要包括手术、放疗和化疗。这些方法在早期癌症治疗中有一定的疗效，但由于其非特异性和对正常细胞的损伤，患者常常面临严重的副作用和较低的生活质量。随着分子生物学和免疫学的发展，新型癌症治疗手段不断涌现，为癌症患者带来了新的希望。近年来，细胞免疫治疗成为癌症治疗领域的研究热点和前沿方向。
2、嵌合抗原受体(chimeric antigen receptors，cars)是在t细胞表面表达的合成蛋白，由细胞外和细胞内两部分组成，此类细胞通常称为car-t细胞。这些受体具有识别并绑定恶性细胞表面特定蛋白质的能力，进而触发t细胞的激活和细胞毒性，以消灭靶向的恶性细胞。
3、嵌合抗原受体是由单克隆抗体片段组成的抗原识别结构域和确保激活car-t细胞效应功能所必需的细胞内信号结构域组成。抗原识别结构域能识别恶性细胞表面的一种特定蛋白质，如b细胞上的cd19。细胞内结构域确保了激活car-t细胞效应功能所必需的细胞内信号。
4、car-t细胞也称嵌合抗原受体t细胞，是一种先进的个体化细胞免疫疗法，通常亦称为car-t免疫疗法，它是一种以嵌合型抗原受体为基础的细胞免疫治疗方案，一般地是通过体外基因转导技术，将编码嵌合抗原受体car-t基因序列导入t细胞中，生成可以结合靶抗原的肿瘤特异性t细胞。最常见的cars包括了一段抗原识别区，比如单克隆抗体(mab)的单链可变区段(scfv)，和激活t细胞胞内信号域的tcrζ链。
5、第一代、第二代和第三代car-t细胞之间存在一定的差异。car-t细胞根据其发展阶段分为第一代、第二代和第三代。第一代car-t细胞利用t细胞受体(tcr)的cd3 ζ链中的细胞内结构域诱导针对靶向恶性细胞的细胞毒性。然而，第一代car-t细胞在回输后不能支持car-t细胞在体内扩增。相比之下，第二代和第三代car-t细胞具有额外的共刺激细胞内结构域，如cd28、41bb、ox40等，这些结构域能增强car-t细胞在体内增殖、扩张和持续存在的能力。第三代car-t细胞则是在第二代的基础上进一步增强了体内扩增和持久性的能力。
6、car-t细胞能够在体内扩增并且呈现一定的持久性。经过基因改造的car-t细胞在体内表现出强大的扩增能力和持久性。在淋巴细胞清除(通常使用氟达拉滨和环磷酰胺)后，car-t细胞在患者体内建立良好的细胞因子环境，进一步增强car-t细胞的扩增能力。一旦将car-t细胞注入体内，细胞数量能够继续增加，并通过工程受体与癌细胞结合，导致免疫癌细胞死亡。有报道称car-t细胞的持久性可长达3年。
7、淋巴细胞清除以及工程受体-癌细胞结合具有特定的生物学效果。通过清除正常的淋巴细胞，为car-t细胞的扩增提供空间；同时，淋巴细胞的清除也清除了潜在的免疫抑制细胞，从而增强了car-t细胞的抗肿瘤效果。工程受体与癌细胞结合是car-t细胞识别并攻击癌细胞的机制，当car-t细胞识别到癌细胞表面的抗原时，就会触发car-t细胞的活化，进而引发对癌细胞的攻击。
8、car-t细胞在临床治疗中已经展现出了巨大的潜力。针对不同的癌症类型，已经有许多car-t细胞治疗方案在临床试验中取得了显著的成果。例如，针对急性淋巴性白血病和淋巴瘤的car-t细胞疗法已经取得了很高的成功率。
9、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，通常缩写为mscs或msc)是一类具有多向分化潜能的多能干细胞，能够分化为多种细胞类型，如骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。mscs不仅在组织修复和再生医学中表现出巨大的潜力，还在细胞间通讯中扮演重要角色。mscs通过分泌外泌体(exosomes)进行细胞间信号传递和物质交换，这些外泌体直径在30-150纳米之间，含有蛋白质、脂类、mrna、mirna等生物活性分子。
10、工程化外泌体传递mrna的方式制备car-t细胞，是一种新兴的基因治疗技术，其基本原理是，通过使用间充质干细胞(msc)来源的外泌体作为载体，将嵌合抗原受体(car)mrna递送到t细胞中，从而实现car-t细胞的快速制备。在car-t细胞治疗中，利用msc来源外泌体进行mrna的传递，能够有效克服传统病毒载体和非病毒载体的局限性，提供一种安全、高效且快速的car-t细胞制备方法。这不仅提高了car-t细胞的生成效率，还大大缩短了治疗周期，提升了治疗效果和安全性。msc来源外泌体作为一种新兴的基因递送载体，在现代生物医学研究中正日益受到关注，并展现出重要的应用潜力。
11、靶向cd19的car-t细胞已经在临床前和临床中表现出惊人的效果，现有研究表明，il-7(白细胞介素-17，interleukin-17)能延长免疫细胞的存活能力，也能刺激成熟t细胞增殖等，所以il-7因子可以增强免疫细胞在体内存活时间及抗肿瘤效果；ccl-17也被称作胸腺和活化调节趋化因子(thymic and activating regulatory chemokine，tarc)，是一种强大的趋化因子，通常与2型免疫反应相关，其编码基因在人类中位于16号染色体上，ccl-17能够提高内源性免疫细胞向肿瘤细胞的聚集能力，进一步增强免疫细胞的抗肿瘤效果。
12、然而，现有技术仍然期待有获得car-t细胞的方法，尤其是期待有通过间充质干细胞来源的工程化外泌体介导mrna，进而制备car-t细胞的方法。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种获得car-t细胞的方法，尤其是提供一种通过间充质干细胞来源的工程化外泌体介导mrna，进而制备car-t细胞的方法。已经出人预料地发现本发明提供的方法能够有效地用于制备car-t细胞，并且能够获得一个或者多个方面的有益效果，本发明基于此类发现而得以完成。
2、为此，本发明第一方面提供了一种制备car-t细胞的方法，其包括如下步骤：
3、(1)构建载体质粒：
4、用pcdna3.1质粒构建含anti-cd3-lamp2b-ms2元件的载体质粒，
5、用pcdna3.1质粒构建anti-cd28-lamp2b-ms2载体质粒，
6、用plvx-ef1α-ires-puro质粒构建car-19mrna-ms2bs载体质粒；
7、(2)间充质干细胞的培养和转染：
8、使用从脐带中剥取的华通氏胶培养获得原代间充质干细胞，再通过传代培养获得p2~p8代的间充质干细胞；使用质粒转染试剂盒(例如lipofectamine™ 3000 reagent试剂盒)将3种质粒转染间充质干细胞；
9、(3)分离和纯化工程化外泌体：
10、使经上一步骤转染的间充质干细胞，更换为不含fbs的dmem-高糖培养基，并将细胞置于含2% o2浓度下的37℃、5% co2培养箱中培养(48小时)；将细胞培养所得上清液使用差速离心法分离并纯化，得到工程化的外泌体；
11、(4)制备初始t细胞：
12、将健康成人外周血离心获得的下层血细胞层用ficoll-hypaque淋巴细胞分离液分离处理，得到外周血单个核细胞(pbmc)层；接着使用磁珠(例如dynabeads®)处理外周血单个核细胞后，在添加il-2 500iu/ml、1%自体血浆的t细胞无血清培养基中活化，得到初始t细胞；
13、(5)制备car-t细胞：
14、将工程化外泌体与初始t细胞共同培养，将培养的细胞悬液离心，沉淀物用添加了il-2和人ab血清的t细胞培养基培养；
15、取细胞悬液离心，细胞沉淀用pbs重悬并调整密度，得到car-t细胞的悬液。
16、根据本发明第一方面的方法，步骤(1)中，用pcdna3.1质粒构建含anti-cd3-lamp2b-ms2元件的载体质粒时，所用质粒和基因片段为：pcdna3.1质粒、anti-cd3-scfv基因序列、lamp2b基因序列、ms2 coat protein基因序列。
17、根据本发明第一方面的方法，步骤(1)中，用pcdna3.1质粒构建含anti-cd3-lamp2b-ms2元件的载体质粒时，按如下操作进行：
18、①设计引物：设计用于扩增anti-cd3-scfv-lamp2b-ms2基因序列，
19、②扩增基因序列：使用pcr方法从模板dna扩增anti-cd3-scfv-lamp2b-ms2序列，
20、③纯化pcr产物：通过琼脂糖凝胶电泳分离pcr产物，切下相应的dna条带并使用凝胶回收试剂盒纯化pcr产物，
21、④双酶切处理：使用ecori和bamhi酶切pcdna3.1质粒，并对anti-cd3-scfv-lamp2b-ms2基因片段进行酶切，
22、⑤连接反应：使用t4 dna连接酶将酶切后的anti-cd3-scfv-lamp2b-ms2基因片段连接到酶切后的pcdna3.1质粒中，
23、⑥转化感受态细胞：将连接反应产物转化到感受态stbl3细胞中，通过热休克法进行转化，转化后的细胞涂布在含有抗生素的lb琼脂板上，37°c培养过夜，
24、⑦筛选阳性克隆：挑选单个菌落，通过小量质粒提取试剂盒提取质粒dna，使用限制性酶切和pcr方法验证质粒中是否含有预期的插入片段，
25、⑧序列验证：送样进行dna测序，以验证anti-cd3-scfv-lamp2b-ms2基因序列的正确性和完整性，确保插入片段的读码框正确，无突变，
26、⑨质粒提取：将阳性克隆采用大量质粒提取试剂盒提取质粒dna，低温保存后备用，即得。
27、根据本发明第一方面的方法，步骤(1)中，考用pcdna3.1质粒构建含anti-cd3-lamp2b-ms2元件的载体质粒的操作，将anti-cd3更换为anti-cd28，用pcdna3.1质粒构建anti-cd28-lamp2b-ms2载体质粒。
28、根据本发明第一方面的方法，步骤(1)中，car-19mrna-ms2bs的序列是由cd19单链可变区、cd8a铰链区、cd8a跨膜区、4-1bb信号、cd3ζ的包浆信号、il-7、ccl17、ms2bs序列构成。
29、根据本发明第一方面的方法，步骤(1)中，选择合适的限制性内切酶(例如，其上游是not i(gcggccgc)、下游是bamh i(ggatcc)的限制性内切酶)和连接酶(例如t4 dna连接酶)，用plvx-ef1α-ires-puro质粒构建car-19mrna-ms2bs载体质粒。
30、根据本发明第一方面的方法，步骤(2)中，使用已知方法从脐带华通氏胶获得原代(p0代)间充质干细胞，再进行传代培养，得到细胞代次为p3~p7代例如p3~p6代例如p4~p6代的间充质干细胞。
31、根据本发明第一方面的方法，步骤(2)中，使用质粒转染试剂盒(例如lipofectamine™ 3000 reagent试剂盒)将3种质粒转染间充质干细胞时，将根据试剂盒处理获得的dna-lipo3000复合物溶液逐滴加入到细胞培养孔板中，轻轻摇晃培养板以均匀分布转染复合物，孵育4-6小时，然后将无血清opti-mem培养基更换为dmem高糖培养基(含10%fbs)，继续培养细胞48-72小时，以允许质粒表达。
32、根据本发明第一方面的方法，步骤(2)中，所述dmem高糖培养基(含10% fbs)是改良dmem高糖培养基(含10% fbs)。
33、根据本发明第一方面的方法，步骤(2)中，质粒转染间充质干细胞是使用lipofectamine™ 3000 reagent试剂盒按如下操作方式进行转染的：
34、(a)将间充质干细胞接种到6孔板中，每孔加入2×105个细胞，37°c、5% co2培养箱中培养使细胞密度达到50-70%融合度；
35、(b)用无血清opti-mem培养基中分别稀释3种质粒dna，按每孔所需的质粒量为2.5µg；在另外一个无血清opti-mem培养基的离心管中，按每个离心管5µl的比例加入lipofectamine 3000试剂；
36、在每个质粒dna溶液中加入10µl的p3000 reagent；
37、将lipofectamine 3000试剂溶液逐滴加入到质粒dna溶液中，轻轻混合，室温孵育15-20分钟以形成dna-lipo3000复合物；
38、(c)将6孔板中的细胞培养基更换为无血清opti-mem培养基；
39、将每管的dna-lipo3000复合物溶液逐滴加入到细胞培养的6孔板中，轻轻摇晃培养板以均匀分布转染复合物；
40、(d)将细胞置于37°c、5% co2培养箱中孵育4-6小时，然后将无血清opti-mem培养基更换为改良dmem高糖培养基(含10% fbs)，继续培养细胞48-72小时，以允许质粒表达。
41、根据本发明第一方面的方法，步骤(3)中，使经上一步骤转染的间充质干细胞培养基，更换为改良dmem-高糖培养基(不含fbs)，并将细胞置于含2% o2浓度下的37℃、5% co2培养箱中培养(例如48小时)。
42、根据本发明第一方面的方法，步骤(3)中，将间充质干细胞在改良dmem-高糖培养基(不含fbs)中培养所得细胞上清液置离心管中，进行如下差速离心法的离心处理获得工程化的外泌体：
43、以300g、4℃离心10分钟，吸取上清液至另一离心管中；
44、以2000g、4℃离心20分钟，吸取上清液至另一离心管中；
45、以10000g、4℃离心30分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后置于另一离心管中；
46、以100000g、4℃离心90分钟，弃上清；
47、向离心管中添加无菌pbs使外泌体沉淀重悬，以100000g、4℃离心90分钟，弃上清液，加无菌pbs使外泌体重悬，得到外泌体悬液。
48、根据本发明第一方面的方法，步骤(2)和/或步骤(3)中，
49、所述dmem高糖培养基(含10% fbs)的配方为：200mg/l的无水cacl2、0.1mg/l的九水fe(no3)3、97.67mg/l的无水mgso4、400mg/l的kcl、3700mg/l的nahco3、6400mg/l的nacl、109mg/l的无水nah2po4，434mg/l的l-丙氨酰-l-谷氨酰胺、30mg/l的甘氨酸、84mg/l的l-精氨酸盐酸盐、62.6mg/l的l-胱氨酸二盐酸盐、584mg/l的l-谷氨酰胺、42mg/l的l-组氨酸盐酸盐一水合物、105mg/l的l-异亮氨酸、105mg/l的l-亮氨酸、146mg/l的l-赖氨酸盐酸盐、30mg/l的l-蛋氨酸、66mg/l的l-苯丙氨酸、42mg/l的l-丝氨酸、95mg/l的l-苏氨酸、16mg/l的l-色氨酸、103.79mg/l的l-酪氨酸二钠盐二水合物、94mg/l的l-缬氨酸，4mg/l的氯化胆碱、4mg/l的d-泛酸钙、4mg/l的叶酸、4mg/l的尼克酰胺、4mg/l的盐酸吡哆醇、0.4mg/l的核黄素、4mg/l的盐酸硫胺素、7.2mg/l的内消旋肌醇，4500mg/l的d-葡萄糖、110mg/l的丙酮酸钠、15mg/l的酚红，100ku/l的青霉素g钠盐、100mg/l的硫酸链霉素，10%胎牛血清，水适量加至全量。
50、根据本发明第一方面的方法，步骤(2)和/或步骤(3)中，所述dmem高糖培养基(不含fbs)的配方为：200mg/l的无水cacl2、0.1mg/l的九水fe(no3)3、97.67mg/l的无水mgso4、400mg/l的kcl、3700mg/l的nahco3、6400mg/l的nacl、109mg/l的无水nah2po4，434mg/l的l-丙氨酰-l-谷氨酰胺、30mg/l的甘氨酸、84mg/l的l-精氨酸盐酸盐、62.6mg/l的l-胱氨酸二盐酸盐、584mg/l的l-谷氨酰胺、42mg/l的l-组氨酸盐酸盐一水合物、105mg/l的l-异亮氨酸、105mg/l的l-亮氨酸、146mg/l的l-赖氨酸盐酸盐、30mg/l的l-蛋氨酸、66mg/l的l-苯丙氨酸、42mg/l的l-丝氨酸、95mg/l的l-苏氨酸、16mg/l的l-色氨酸、103.79mg/l的l-酪氨酸二钠盐二水合物、94mg/l的l-缬氨酸，4mg/l的氯化胆碱、4mg/l的d-泛酸钙、4mg/l的叶酸、4mg/l的尼克酰胺、4mg/l的盐酸吡哆醇、0.4mg/l的核黄素、4mg/l的盐酸硫胺素、7.2mg/l的内消旋肌醇，4500mg/l的d-葡萄糖、110mg/l的丙酮酸钠、15mg/l的酚红，100ku/l的青霉素g钠盐、100mg/l的硫酸链霉素，水适量加至全量。
51、根据本发明第一方面的方法，步骤(2)和/或步骤(3)中，所述改良dmem高糖培养基(含10% fbs)的配方为：200mg/l的无水cacl2、0.1mg/l的九水fe(no3)3、97.67mg/l的无水mgso4、400mg/l的kcl、3700mg/l的nahco3、6400mg/l的nacl、109mg/l的无水nah2po4、124mg/l的花生四烯酸钠、56mg/l的硫酸锌，434mg/l的l-丙氨酰-l-谷氨酰胺、30mg/l的甘氨酸、84mg/l的l-精氨酸盐酸盐、62.6mg/l的l-胱氨酸二盐酸盐、584mg/l的l-谷氨酰胺、42mg/l的l-组氨酸盐酸盐一水合物、105mg/l的l-异亮氨酸、105mg/l的l-亮氨酸、146mg/l的l-赖氨酸盐酸盐、30mg/l的l-蛋氨酸、66mg/l的l-苯丙氨酸、42mg/l的l-丝氨酸、95mg/l的l-苏氨酸、16mg/l的l-色氨酸、103.79mg/l的l-酪氨酸二钠盐二水合物、94mg/l的l-缬氨酸，4mg/l的氯化胆碱、4mg/l的d-泛酸钙、4mg/l的叶酸、4mg/l的尼克酰胺、4mg/l的盐酸吡哆醇、0.4mg/l的核黄素、4mg/l的盐酸硫胺素、7.2mg/l的内消旋肌醇，4500mg/l的d-葡萄糖、110mg/l的丙酮酸钠、15mg/l的酚红，100ku/l的青霉素g钠盐、100mg/l的硫酸链霉素，10%胎牛血清，水适量加至全量。
52、根据本发明第一方面的方法，步骤(2)和/或步骤(3)中，所述改良dmem高糖培养基(不含fbs)的配方为：200mg/l的无水cacl2、0.1mg/l的九水fe(no3)3、97.67mg/l的无水mgso4、400mg/l的kcl、3700mg/l的nahco3、6400mg/l的nacl、109mg/l的无水nah2po4、124mg/l的花生四烯酸钠、56mg/l的硫酸锌，434mg/l的l-丙氨酰-l-谷氨酰胺、30mg/l的甘氨酸、84mg/l的l-精氨酸盐酸盐、62.6mg/l的l-胱氨酸二盐酸盐、584mg/l的l-谷氨酰胺、42mg/l的l-组氨酸盐酸盐一水合物、105mg/l的l-异亮氨酸、105mg/l的l-亮氨酸、146mg/l的l-赖氨酸盐酸盐、30mg/l的l-蛋氨酸、66mg/l的l-苯丙氨酸、42mg/l的l-丝氨酸、95mg/l的l-苏氨酸、16mg/l的l-色氨酸、103.79mg/l的l-酪氨酸二钠盐二水合物、94mg/l的l-缬氨酸，4mg/l的氯化胆碱、4mg/l的d-泛酸钙、4mg/l的叶酸、4mg/l的尼克酰胺、4mg/l的盐酸吡哆醇、0.4mg/l的核黄素、4mg/l的盐酸硫胺素、7.2mg/l的内消旋肌醇，4500mg/l的d-葡萄糖、110mg/l的丙酮酸钠、15mg/l的酚红，100ku/l的青霉素g钠盐、100mg/l的硫酸链霉素，水适量加至全量。
53、根据本发明第一方面的方法，步骤(4)中，按如下操作获得初始t细胞：
54、将含有枸橼酸纳抗凝剂的健康成人外周血100ml置于250ml离心杯中，1500rpm、20℃离心15min，收集上层血浆；
55、将下层血细胞层加入等体积的0.9%氯化钠注射液中充分混匀，在50ml离心管中加入20ml ficoll-hypaque淋巴细胞分离液，然后将等体积的血细胞悬液沿管壁缓慢加入至淋巴细胞分离液上层，然后将离心管以2000rpm离心20min，调整离心机的升降速为0；
56、将离心后的细胞悬液上清液层吸弃后，小心吸取中间白膜层，即为外周血单个核细胞层即pbmc层；
57、将dynabeads®磁珠置于涡旋混合器上充分混匀30秒，按照dynabeads®：pbmc=1:1的比例计算所需dynabeads®的数量/总体积，将等体积的pbs添加至dynabeads®中，充分混匀；
58、将dynabeads®置于磁力架上1min，吸弃上清液，添加等体积的pbs后，重复该步骤3次；
59、将dynabeads®从磁力架上取下，添加t细胞无血清培养基，充分混匀；
60、将dynabeads®与pbmc充分混合，涡旋混合器混悬10秒钟后，25℃静置10min；按照pbmc 1×106/ml接种密度接种至培养瓶中，使细胞在添加il-2 500iu/ml、1%自体血浆的t细胞无血清培养基中，置于37℃、5% co2培养箱中活化24h，获得初始t细胞。
61、根据本发明第一方面的方法，步骤(5)中，使步骤(3)所得工程化的外泌体与步骤(4)所得初始t细胞按照1×109粒/ml外泌体：1×106/ml t细胞的比例充分混匀，接种至培养孔板中，置于37℃、5% co2培养箱中过夜培养。
62、根据本发明第一方面的方法，步骤(5)中，外泌体与初始t细胞共过夜培养后，将细胞悬液吸出，300g离心5分钟，吸弃上清液后，加t细胞培养基并添加il-2至浓度500iu/ml、培养基体积计5%的人ab血清，置于37℃、5% co2培养箱培养，每48小时补加新鲜的培养基并调整细胞密度为1×106/ml；
63、根据本发明第一方面的方法，步骤(5)中，在含il-2和人ab血清的培养基中培养7天后，吸取细胞悬液，离心弃上清，细胞沉淀用pbs重悬后，调整密度，得到car-t细胞的悬液。
64、本发明通过上述方法，能够有效地获得car-t细胞，并且呈现本发明上下文所述优良效果。
65、嵌合抗原受体(car)t细胞疗法近年来已成为癌症治疗中的一项有前景的技术。然而，目前大多数car-t细胞的生成依赖于病毒转导，这种方法虽然能诱导car的持久表达，但可能引发严重的不良反应。为了克服这些挑战，本发明开发了一种工程化外泌体递送平台，利用噬菌体ms2系统与外泌体上的溶酶体相关膜蛋白2b(lamp2b)结合，将ms2衣壳蛋白连接至lamp2b的c端，并将ms2结合位点(ms2bs)插入报告基因的3'非翻译区(utr)。lamp2b是外泌体的标志蛋白，通过ms2与ms2bs的相互作用，car结构的mrna被有效加载到外泌体中，利用该工程化外泌体将car-19mrna和anti-cd3/cd28单链可变片段(scfvs)递送至t细胞，外泌体膜外表达的anti-cd3/cd28的scfvs可有效激活初级t细胞，同时外泌体将car-19mrna传递到t细胞内合成car蛋白，然后生成具有癌细胞杀伤能力的car-t细胞。
66、针对目前car-t技术实际需求，本发明提供了共表达il-7和ccl17的cd19 car表达质粒的构建，不仅能将il-7分泌到t细胞外，而且使ccl-17最大程度招募外周血免疫细胞，进一步提高car-t的肿瘤细胞杀伤能力。
67、本发明的总体技术方案示意性的如图1所示。如本发明上下文详述的，本发明获得了一个或者多个方面的有益效果。
1.制备car-t细胞的方法，其包括如下步骤：
2.根据权利要求1的方法，步骤(1)中：
3.根据权利要求1的方法，步骤(2)中：
4.根据权利要求1的方法，步骤(3)中，使经上一步骤转染的间充质干细胞培养基，更换为改良dmem-高糖培养基(不含fbs)，并将细胞置于含2% o2浓度下的37℃、5% co2培养箱中培养(例如48小时)。
5.根据权利要求1的方法，步骤(3)中，将间充质干细胞在改良dmem-高糖培养基(不含fbs)中培养所得细胞上清液置离心管中，进行如下差速离心法的离心处理获得工程化的外泌体：
6.根据权利要求1的方法，步骤(2)和/或步骤(3)中，所述dmem高糖培养基(含10% fbs)的配方为：200mg/l的无水cacl2、0.1mg/l的九水fe(no3)3、97.67mg/l的无水mgso4、400mg/l的kcl、3700mg/l的nahco3、6400mg/l的nacl、109mg/l的无水nah2po4，434mg/l的l-丙氨酰-l-谷氨酰胺、30mg/l的甘氨酸、84mg/l的l-精氨酸盐酸盐、62.6mg/l的l-胱氨酸二盐酸盐、584mg/l的l-谷氨酰胺、42mg/l的l-组氨酸盐酸盐一水合物、105mg/l的l-异亮氨酸、105mg/l的l-亮氨酸、146mg/l的l-赖氨酸盐酸盐、30mg/l的l-蛋氨酸、66mg/l的l-苯丙氨酸、42mg/l的l-丝氨酸、95mg/l的l-苏氨酸、16mg/l的l-色氨酸、103.79mg/l的l-酪氨酸二钠盐二水合物、94mg/l的l-缬氨酸，4mg/l的氯化胆碱、4mg/l的d-泛酸钙、4mg/l的叶酸、4mg/l的尼克酰胺、4mg/l的盐酸吡哆醇、0.4mg/l的核黄素、4mg/l的盐酸硫胺素、7.2mg/l的内消旋肌醇，4500mg/l的d-葡萄糖、110mg/l的丙酮酸钠、15mg/l的酚红，100ku/l的青霉素g钠盐、100mg/l的硫酸链霉素，10%胎牛血清，水适量加至全量；或者，所述dmem高糖培养基(不含fbs)的配方为：200mg/l的无水cacl2、0.1mg/l的九水fe(no3)3、97.67mg/l的无水mgso4、400mg/l的kcl、3700mg/l的nahco3、6400mg/l的nacl、109mg/l的无水nah2po4，434mg/l的l-丙氨酰-l-谷氨酰胺、30mg/l的甘氨酸、84mg/l的l-精氨酸盐酸盐、62.6mg/l的l-胱氨酸二盐酸盐、584mg/l的l-谷氨酰胺、42mg/l的l-组氨酸盐酸盐一水合物、105mg/l的l-异亮氨酸、105mg/l的l-亮氨酸、146mg/l的l-赖氨酸盐酸盐、30mg/l的l-蛋氨酸、66mg/l的l-苯丙氨酸、42mg/l的l-丝氨酸、95mg/l的l-苏氨酸、16mg/l的l-色氨酸、103.79mg/l的l-酪氨酸二钠盐二水合物、94mg/l的l-缬氨酸，4mg/l的氯化胆碱、4mg/l的d-泛酸钙、4mg/l的叶酸、4mg/l的尼克酰胺、4mg/l的盐酸吡哆醇、0.4mg/l的核黄素、4mg/l的盐酸硫胺素、7.2mg/l的内消旋肌醇，4500mg/l的d-葡萄糖、110mg/l的丙酮酸钠、15mg/l的酚红，100ku/l的青霉素g钠盐、100mg/l的硫酸链霉素，水适量加至全量；或者，所述改良dmem高糖培养基(含10% fbs)的配方为：200mg/l的无水cacl2、0.1mg/l的九水fe(no3)3、97.67mg/l的无水mgso4、400mg/l的kcl、3700mg/l的nahco3、6400mg/l的nacl、109mg/l的无水nah2po4、124mg/l的花生四烯酸钠、56mg/l的硫酸锌，434mg/l的l-丙氨酰-l-谷氨酰胺、30mg/l的甘氨酸、84mg/l的l-精氨酸盐酸盐、62.6mg/l的l-胱氨酸二盐酸盐、584mg/l的l-谷氨酰胺、42mg/l的l-组氨酸盐酸盐一水合物、105mg/l的l-异亮氨酸、105mg/l的l-亮氨酸、146mg/l的l-赖氨酸盐酸盐、30mg/l的l-蛋氨酸、66mg/l的l-苯丙氨酸、42mg/l的l-丝氨酸、95mg/l的l-苏氨酸、16mg/l的l-色氨酸、103.79mg/l的l-酪氨酸二钠盐二水合物、94mg/l的l-缬氨酸，4mg/l的氯化胆碱、4mg/l的d-泛酸钙、4mg/l的叶酸、4mg/l的尼克酰胺、4mg/l的盐酸吡哆醇、0.4mg/l的核黄素、4mg/l的盐酸硫胺素、7.2mg/l的内消旋肌醇，4500mg/l的d-葡萄糖、110mg/l的丙酮酸钠、15mg/l的酚红，100ku/l的青霉素g钠盐、100mg/l的硫酸链霉素，10%胎牛血清，水适量加至全量；或者，所述改良dmem高糖培养基(不含fbs)的配方为：200mg/l的无水cacl2、0.1mg/l的九水fe(no3)3、97.67mg/l的无水mgso4、400mg/l的kcl、3700mg/l的nahco3、6400mg/l的nacl、109mg/l的无水nah2po4、124mg/l的花生四烯酸钠、56mg/l的硫酸锌，434mg/l的l-丙氨酰-l-谷氨酰胺、30mg/l的甘氨酸、84mg/l的l-精氨酸盐酸盐、62.6mg/l的l-胱氨酸二盐酸盐、584mg/l的l-谷氨酰胺、42mg/l的l-组氨酸盐酸盐一水合物、105mg/l的l-异亮氨酸、105mg/l的l-亮氨酸、146mg/l的l-赖氨酸盐酸盐、30mg/l的l-蛋氨酸、66mg/l的l-苯丙氨酸、42mg/l的l-丝氨酸、95mg/l的l-苏氨酸、16mg/l的l-色氨酸、103.79mg/l的l-酪氨酸二钠盐二水合物、94mg/l的l-缬氨酸，4mg/l的氯化胆碱、4mg/l的d-泛酸钙、4mg/l的叶酸、4mg/l的尼克酰胺、4mg/l的盐酸吡哆醇、0.4mg/l的核黄素、4mg/l的盐酸硫胺素、7.2mg/l的内消旋肌醇，4500mg/l的d-葡萄糖、110mg/l的丙酮酸钠、15mg/l的酚红，100ku/l的青霉素g钠盐、100mg/l的硫酸链霉素，水适量加至全量。
7.根据权利要求1的方法，步骤(4)中，按如下操作获得初始t细胞：
8.根据权利要求1的方法，步骤(5)中，使步骤(3)所得工程化的外泌体与步骤(4)所得初始t细胞按照1×109粒/ml外泌体：1×106/ml t细胞的比例充分混匀，接种至培养孔板中，置于37℃、5% co2培养箱中过夜培养。
9.根据权利要求1的方法，步骤(5)中，外泌体与初始t细胞共过夜培养后，将细胞悬液吸出，300g离心5分钟，吸弃上清液后，加t细胞培养基并添加il-2至浓度500iu/ml、培养基体积计5%的人ab血清，置于37℃、5% co2培养箱培养，每48小时补加新鲜的培养基并调整细胞密度为1×106/ml。
10.根据权利要求1的方法，步骤(5)中，在含il-2和人ab血清的培养基中培养7天后，吸取细胞悬液，离心弃上清，细胞沉淀用pbs重悬后，调整密度，得到car-t细胞的悬液。
