本发明涉及生物，尤其涉及一种双基因修饰的干细胞诱导分化胰岛β细胞的制备方法。
背景技术：
1、pdx1(胰十二指肠同源框基因1)是胰腺发生与发育相关的关键转录因子之一，在胚胎发育过程中它能促进胰腺的早期发育和晚期细胞分化，在成体中能帮助维持b细胞的形态和功能，与此同时它也可以启动自身基因及调控下游基因的表达，参与调控胰岛细胞特异性表达的多种基因，其中主要的有葡萄糖激酶(gk)，神经元素3(neurogenin3，ngn3)，胰岛素(insulin)，胰高血糖素(glucagon)，葡萄糖转运体-2(glucosetransporter-2，glut2)等，而这些基因都参与胰腺细胞的分化成熟。大量研究证实，pdx1表达缺失的鼠胰腺组织不发育而出现严重的糖尿病，提示pdx1基因在胰腺发育过程中及维持细胞正常生理功能等方面扮演重要角色。
2、neurod基因在人类2号染色体长臂3区2带(2q32)上，其基因定位邻近于1型糖尿病基因iddm7(d2s152)位点处，人们对其基因变异与糖尿病的关系进行了一系列研究。结果发现：neurod基因45位密码子211核苷酸处g(a突变，导致氨基酸发生改变(ala45(thr)，而与2型糖尿病的关系尚不明确。有实验证实，neurod对胰岛素基因的表达和调控有着重要影响，动物实验也证实neurod对胰腺的发育过程起着至关重要的作用。小鼠胚胎期9.5d胰腺即已开始发育，一直到整个胰腺发育完成，在β细胞内均可测及neurod蛋白。出生后在所有成熟β细胞和少量α细胞内均见蛋白表达。
3、糖尿病已成为严重危害国民健康并给社会带来沉重经济负担的重大公共卫生问题修复患者的胰岛β细胞数量和功能是糖尿病治疗的根本途径，其中β细胞再生是极具潜在应用价值的研究方向。由于供体来源和免疫排斥两方面的原因，人类胰岛移植难以大规模推广，寻找新的潜在的β细胞来源成为人们努力的目标。但由于胰岛细胞球的独特三维结构，现行方法(二维细胞因子诱导培养方法)仍不能给胰岛细胞生长及成团提供最佳的三维细胞微环境，导致胰岛β细胞诱导分化率低，同时其胰岛素合成与分泌功能也比较差。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本发明提供了一种双基因修饰的干细胞诱导分化胰岛β细胞的制备方法。
2、第一方面，本发明提供了一种双基因表达padxsi-cmv-pdxi/cmv-neurod1腺病毒载体，所述双基因表达padxsi-cmv-pdxi/cmv-neurod1腺病毒载体的制备方法包括以下步骤：
3、将puc57-pdx1和puc57-neurod1分别使用bglii和xhoi限制性内切酶进行酶切，酶切下pdx1和neurod1连接到pshuttle-gfp-cmv重组穿梭载体，收获pshuttle-gfp-cmv-pdx1/pshuttle-gfp-cmv-neurod1质粒；
4、将所述pshuttle-gfp-cmv-pdx1/pshuttle-gfp-cmv-neurod1质粒转接到padxsi载体上，收获padxsi-cmv-pdx1/neurod1重组病毒质粒；
5、将所述padxsi-cmv-pdx1/neurod1重组病毒质粒转染至293细胞，包装出完整的腺病毒，得到双基因表达padxsi-cmv-pdxi/cmv-neurod1腺病毒载体。
6、第二方面，本发明提供了一种双基因修饰的干细胞诱导分化胰岛β细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤：
7、得到huscs；
8、采用权利要求1所述的双基因表达padxsi-cmv-pdxi/cmv-neurod1腺病毒载体转染所述huscs；
9、携带padxsi-cmv-pdxi/cmv-neurod1腺病毒感染huscs联合细胞因子诱导分化为胰岛β细胞培养。
10、进一步地，所述得到huscs的步骤包括以下过程：
11、采用贴壁法从人体新鲜尿液中提取原代干细胞huscs；
12、将所述原代干细胞huscs进行扩增传代培养，三次传代后即可得到huscs。
13、进一步地，所述携带padxsi-cmv-pdxi/cmv-neurod1腺病毒感染huscs联合细胞因子诱导分化为胰岛β细胞培养的步骤包括预诱导分化、一阶段诱导分化、二阶段诱导分化和三阶段诱导分化。
14、进一步地，所述预诱导分化的工作条件参数包括：大鼠胰岛素瘤细胞裂解提取物30-80ug/ml，0.5-2％胰岛素转铁蛋白-硒its，培养基dmemf/12诱导1-3天。
15、进一步地，所述一阶段诱导分化的工作条件参数包括：10-100ng/mlegf、0.5-5％(v/v)b27、20-60ng/ml胰高血糖素样肽-1(glp-1)+dmemf/12诱导2-4天。
16、进一步地，所述二阶段诱导分化的工作条件参数包括：20-60ng/mlglp-1、40-60ng/ml人细胞调节素、0.5-5％(v/v)b27、10-100ng/mlegf、5-30ng/mlhgf+含1-10％fbs的dmemf/12诱导6-8天。
17、进一步地，所述三阶段诱导分化的工作条件参数包括：5-20mm烟酰胺(nic)、0.1-1.0mmol/lβ-巯基乙醇、5-30ng/mlhgf+1-10％fbs的dmemf/12诱导6-8天。
18、第三方面，本发明提供了一种胰岛β细胞，所述胰岛β细胞是采用第二方面任一项所述的双基因修饰的干细胞诱导分化胰岛β细胞的制备方法制得。
19、本发明实施例提供的上述技术方案与现有技术相比至少具有如下优点：
20、本发明实施例提供了一一种双基因修饰的干细胞诱导分化胰岛β细胞的制备方法，通过构建双基因表达padxsi-cmv-pdxi/cmv-neurod1腺病毒载体联合多种细胞因子在nunclonsphera3d培养系统中诱导huscs分化为胰岛β细胞。nunclonsphera3d培养耗材通过调控细胞黏附能力、弹性模量和应力松弛等多种力学性能，能够控制细胞自发形成三维多细胞球结构可以更好提供胰岛细胞所需营养、进行物质交换、更接近胰岛β细胞最优生长条件；同时双基因表达padxsi-cmv-pdxi/cmv-neurod1腺病毒载体的修饰诱导的胰岛β细胞(ipcs)胰岛素合成分泌相关的pdx1、neurod1等基因在转录水平及蛋白表达水平以及在胰岛素、c肽分泌量功均显著高于目前常规多细胞因子的二维培养方法。
1.一种双基因表达padxsi-cmv-pdxi/cmv-neurod1腺病毒载体，其特征在于，所述双基因表达padxsi-cmv-pdxi/cmv-neurod1腺病毒载体的制备方法包括以下步骤：
2.一种双基因修饰的干细胞诱导分化胰岛β细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的双基因修饰的干细胞诱导分化胰岛β细胞的制备方法，其特征在于，所述得到huscs的步骤包括以下过程：
4.根据权利要求2所述的双基因修饰的干细胞诱导分化胰岛β细胞的制备方法，其特征在于，所述携带padxsi-cmv-pdxi/cmv-neurod1腺病毒感染huscs联合细胞因子诱导分化为胰岛β细胞培养的步骤包括预诱导分化、一阶段诱导分化、二阶段诱导分化和三阶段诱导分化。
5.根据权利要求4所述的双基因修饰的干细胞诱导分化胰岛β细胞的制备方法，其特征在于，所述预诱导分化的工作条件参数包括：大鼠胰岛素瘤细胞裂解提取物30-80ug/ml，0.5-2％胰岛素转铁蛋白-硒its，培养基dmemf/12诱导1-3天。
6.根据权利要求4所述的双基因修饰的干细胞诱导分化胰岛β细胞的制备方法，其特征在于，所述一阶段诱导分化的工作条件参数包括：10-100ng/mlegf、0.5-5％(v/v)b27、20-60ng/ml胰高血糖素样肽-1(glp-1)+dmemf/12诱导2-4天。
7.根据权利要求4所述的双基因修饰的干细胞诱导分化胰岛β细胞的制备方法，其特征在于，所述二阶段诱导分化的工作条件参数包括：20-60ng/mlglp-1、40-60ng/ml人细胞调节素、0.5-5％(v/v)b27、10-100ng/mlegf、5-30ng/mlhgf+含1-10％fbs的dmemf/12诱导6-8天。
8.根据权利要求4所述的双基因修饰的干细胞诱导分化胰岛β细胞的制备方法，其特征在于，所述三阶段诱导分化的工作条件参数包括：5-20mm烟酰胺(nic)、0.1-1.0mmol/lβ-巯基乙醇、5-30ng/mlhgf+1-10％fbs的dmemf/12诱导6-8天。
9.一种胰岛β细胞，其特征在于，所述胰岛β细胞是采用权利要求2～8任一项所述的双基因修饰的干细胞诱导分化胰岛β细胞的制备方法制得。
