本发明涉及一种用于dili早期诊断的高灵敏纳米系统、其制备方法及应用，属于医药。
背景技术：
1、药源性肝损伤(drug-induced liver injury，dili)是指由药物本身及其代谢产物等所致的肝损伤，据统计，dili约占临床安全问题的25％，其发病率高达19/100000～40/100000，已成为严重的临床安全问题。dili的发病与用药关联常较隐蔽，临床上dili的诊断属于排除性诊断，由于患者个体差异大且缺乏有效的诊断标志物，dili早期诊断仍是临床中亟待解决的关键科学难题。临床常用的dili诊断方法存在以下问题：①生化指标检查：dili临床诊断的“金标准”，谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,alt)和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,ast)等指标，用于诊断时因缺乏特异性而易引起假阳性判断，且这些生化指标易降解，临床上往往需要新鲜血液样本；②影像学检查：设备依赖性强、专业技术要求高，难以用于大批量筛查；③肝穿活检：肝穿活检有助于明确诊断结果和评估病损程度，但其损害性大，患者顺应性差。为了弥补当前诊断方法的不足，多种新型dili生物标志物得到开发。已有研究表明，血清中肝来源外泌体mirna可作为dili早期、特异性诊断的生物标志物，如肝脏保守mir122，其异常表达与dili损伤程度密切相关。
2、现存的外泌体mirna检测技术如northern blot、rt-qpcr等，主要包括外泌体的分离、提取及mirna的定量测定等实验过程，操作步骤复杂且仪器昂贵。冗长的分离步骤极易引起外泌体的损害和污染，且难以分离得到组织特异性来源的外泌体；mirna的提取及扩增过程极易引起mirna降解；因而上述检测方法难以做到精准检测。开发一种可选择性识别并主动富集肝来源外泌体、并在外泌体原位完成mirna即时、高灵敏检测的方法，对实现dili早期、高精准诊断具有重要意义。
技术实现思路
1、发明目的：本发明的目的是提供了一种用于dili早期诊断的高灵敏纳米系统、其制备方法及应用。
2、技术方案：本发明提供了一种用于dili早期诊断的高灵敏纳米系统，所述纳米系统包括携带lhbs的工程化囊泡、crispr-cha系统和fe3o4纳米粒子；所述crispr-cha系统包括探针d-tri、h1、h2、cas13a/crrna复合物和10×reaction缓冲液；d-tri的核苷酸序列如seq id no.1所示，h1的核苷酸序列如seq id no.2所示，h2的核苷酸序列如seq id no.3所示，cas13a/crrna复合物包括10×reaction缓冲液、crrna和cas13a核酸酶。
3、本发明还提供了上述用于dili早期诊断的高灵敏纳米系统的制备方法，包括以下步骤：
4、(1)构建乙型肝炎病毒大表面蛋白lhbs基因稳转细胞株，扩大培养，提取细胞膜，即得携带lhbs的工程化囊泡；
5、(2)将10×reaction缓冲液、crrna、cas13a核酸酶和无核酸酶的超纯水混合孵育，得到cas13a/crrna复合物；将探针d-tri、h1、h2进行预处理加热变性，冷却至室温后与cas13a/crrna复合物混合，即得crispr-cha系统；
6、(3)将fecl3·6h2o加入超纯水，在氮气保护下不断搅拌，再加入na2so3溶液、聚天冬氨酸钠盐溶液、氨水，反应后收集粗产物，向其中加入丙酮，磁分离去除上清，在沉淀中加入乙醇再次进行磁分离，洗涤，将沉淀分散于ddh2o中，透析，取上清液离心，得到上清液即为fe3o4纳米粒子溶液；
7、(4)将携带lhbs的工程化囊泡、crispr-cha系统和fe3o4纳米粒子溶液混合，纯化，即得用于dili早期诊断的高灵敏纳米系统。
8、进一步地，步骤(2)中所述crispr-cha系统中d-tri、h1和h2探针的终浓度为200nm。
9、进一步地，步骤(2)中所述crispr-cha系统中cas13a/crrna复合物和10×reaction缓冲液的体积比为5:1。
10、本发明还提供了上述纳米系统在制备药源性肝损伤检测试剂中的应用。
11、进一步地，所述纳米系统的终浓度为1×104个/μl。
12、进一步地，所述纳米系统用于检测mir122的浓度。
13、进一步地，所述应用为将纳米系统与不同浓度的mir122混合孵育，测定荧光强度，绘制线性方法；将纳米系统与待测血清混合孵育，测定荧光强度，带入线性方程即得待测血清中mir122的浓度。
14、进一步地，所述mir122的浓度为10-13～10-7m。
15、进一步地，所述孵育条件为37℃孵育60～90min。
16、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明的用于dili早期诊断的高灵敏纳米系统，可选择性识别肝来源外泌体并在外泌体原位完成外泌体mirna的即时检测，无需额外提取及富集mirna，有效避免了mirna提取过程引起的降解。用于检测肝原细胞内的mir122，特异性强，灵敏度高，不仅为dili的早期、高精准、快速便捷诊断提了供新方法，也为其它疾病早期诊断提供了新研究思路。
1.一种用于dili早期诊断的高灵敏纳米系统，其特征在于，所述纳米系统包括携带lhbs的工程化囊泡、crispr-cha系统和fe3o4纳米粒子；所述crispr-cha系统包括探针d-tri、h1、h2、cas13a/crrna复合物和10×reaction缓冲液；d-tri的核苷酸序列如seq idno.1所示，h1的核苷酸序列如seq id no.2所示，h2的核苷酸序列如seq id no.3所示，cas13a/crrna复合物包括10×reaction缓冲液、crrna和cas13a核酸酶。
2.权利要求1所述的用于dili早期诊断的高灵敏纳米系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述crispr-cha系统中d-tri、h1和h2探针的终浓度为200nm。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述crispr-cha系统中cas13a/crrna复合物和10×reaction缓冲液的体积比为5:1。
5.权利要求1所述的纳米系统在制备药源性肝损伤检测试剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述纳米系统的终浓度为1×104个/μl。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述纳米系统用于检测mir122的浓度。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用为将纳米系统与不同浓度的mir122混合孵育，测定荧光强度，绘制线性方法；将纳米系统与待测血清混合孵育，测定荧光强度，带入线性方程即得待测血清中mir122的浓度。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述mir122的浓度为10-13～10-7m。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述孵育条件为37℃孵育60～90min。
