本技术涉及癌症领域，特别地涉及cd19抗原结合结构域和包含这样的cd19抗原结合结构域的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)及其使用方法。
背景技术：
1、癌症是对人健康最致命的威胁之一。仅在美国，癌症每年影响接近130万例新患者，并且其是继心血管疾病之后第二位的主要死亡原因，其引起约四分之一的死亡。实体瘤是这些死亡中的大多数的原因。尽管在某些癌症的医学治疗方面已取得显著进步，但在过去的20年内所有癌症的总体5年存活率仅提高约10％。癌症或恶性肿瘤转移并且以不受控制的方式迅速生长，使得治疗极其困难。
2、cd19是85至95kda的跨膜细胞表面糖蛋白受体。cd19是蛋白质的免疫球蛋白(ig)超家族的成员，并且包含两个胞外ig样结构域、一个跨膜结构域和一个胞内信号传导结构域(tedder tf,isaacs,cm,1989,jimmunol 143:712-171)。cd19修饰b细胞受体信号传导，降低b细胞受体对抗原的触发阈值(carter,rh,and fearon,dt,1992,science,256:105-107)，并与cd81和cd21协同以调节这一必需的b细胞信号传导复合物(bradbury,le,kansasgs,levy s,evans rl,tedder tf,1992,jimmunol,149:2841-50)。在b细胞个体发育(ontogeny)期间cd19能够独立于抗原受体在祖b细胞(pro-b)、前-前-b细胞(pre-pre-bcell)、前-b细胞(pre-b)、早期b细胞(early b cell)阶段发出信号，并且与src家族蛋白酪氨酸激酶相关，是酪氨酸磷酸化的，诱导胞内钙调动(calciummobilization)和肌醇磷脂信号传导二者(uckun fm,burkhardt al,jarvis l,jun x,stealy b,dibirdik i,myers de,tuel-ahlgren l,bolen jb,1983,j biol chem 268:21172-84)。与b细胞恶性肿瘤的治疗相关的关键点是cd19在正常b细胞上以严格调节的方式表达，受限于处于igh基因重排阶段的早期b细胞前体、成熟b细胞，但在造血干细胞或成熟浆细胞上不表达(anderson,kc,bates,mp,slaughenhout bl,pinkus gs,schlossman sf,nadler lm,1984,blood 63:1424-1433)。
3、目前针对b谱系白血病的护理标准可由以下组成：通过高剂量的化学治疗或放射的缓解诱导治疗，然后进行巩固，以及可根据需要以干细胞移植和另外的化学治疗疗程为特色(参见在cancer.gov的万维网)。与这些治疗相关的高毒性以及并发症的风险(例如复发、继发性恶性肿瘤或gvhd)促使寻求更好的治疗替代方案。cd19在成人和儿童(前b-all)b细胞恶性肿瘤二者上的表达已导致针对抗体和基于嵌合抗原受体(car)-t细胞二者的治疗均利用该靶标(kochenderfer jn,wilson wh,janik je,dudley me,stetler-stevensonm,feldman sa,maric i,raffeld m,nathan da,lanier bj,morgan ra,rosenberg sa,2010,blood116:4099-102；lee dw,kochenderfer jn,stetler-stevenson m,cui yk,delbrook c,feldman sa,orentas r,sabatino m,shah nn,steinberg sm,stroncek d,tschernia n,yuan c,zhang h,zhang l,rosenberg sa,wayne as,mackall cl,2015,lancet 385:517-28)。
4、已开发了许多治疗b细胞白血病和淋巴瘤的新方法，其包括将抗cd19结合基序与t细胞结合基序连接的双特异性抗体(即博纳吐单抗(blinatumomab)，适用于治疗费城染色体阴性(philadelphia chromosome-negative)复发性或难治性b细胞前体急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，all)。迄今为止，在car构建体中采用的cd19的许多结合部分利用了来源于鼠抗体的结构域。目前正在考虑批准这些产品中的许多，包括由novartis和kite pharmaceuticals所开发的那些。在2017年4月，novartis宣布ctl019(tisagenlecleucel)获得了fda突破性认定，用于治疗患有难治性或复发性(r/r)dlbcl(弥漫性大b细胞淋巴瘤(diffuse large b cell lymphoma))的两次或更多次既往治疗失败的成人患者，将该认定添加至针对r/r b细胞急性淋巴细胞白血病(all)的认定。这些适应证分别基于ii期juliet研究(nct02445248)和eliana研究(nct02435849)。juliet试验示出总响应率(overall response rate，orr)为45％，其中在三个月时具有37％完全响应(complete response，cr)和8％部分响应(partial response，pr)。在eliana研究中，输注该产品的患者中82％达到cr或计数恢复不完全的cr，并且在6个月时无复发存活率为60％。来自kite pharmaceuticals的car-t产品(kte-c19，axicabtagene ciloleucel)针对弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlblc)、转化滤泡性淋巴瘤(transformed follicular lymphoma，tfl)和原发性纵隔b细胞淋巴瘤(primary mediastinal b-cell lymphoma，pmbcl)被授予突破性认定。在kte-c19在r/r all中的kite zuma-3ii期试验中，报告了73％的cr(在2个月或更长时间时)。所有信息均来自公司新闻稿。无论是否利用了car-t治疗的抗体，仍有相当数量的患者无法通过这些治疗获得帮助，并且有可观的空间用于改善的治疗方法。
5、嵌合抗原受体(car)是包含以下三个基本单元的杂合分子：(1)胞外抗原结合基序、(2)连接/跨膜基序，以及(3)胞内t细胞信号传导基序(long ah,haso wm,orentasrj.lessons learned from a highly-active cd22-specific chimeric antigenreceptor.oncoimmunology.2013；2(4):e23621)。car的抗原结合基序通常仿效免疫球蛋白(ig)分子的最小结合结构域，单链可变片段(single chain fragment variable，scfv)。还已改造了替选的抗原结合基序，例如受体配体(即，已将il-13改造成结合肿瘤表达的il-13受体)、完整免疫受体、文库来源肽和固有免疫系统效应分子(例如nkg2d)。用于car表达的替选细胞靶标(例如nk或γ-δt细胞)也在开发之中(brown ce et al clin cancerres.2012；18(8):2199–209；lehner m et al.plos one.2012；7(2):e31210)。关于限定最活跃的t细胞群以用car载体进行传导、确定最佳的培养和扩增技术，以及限定car蛋白结构本身的分子细节，仍有大量工作有待完成。
6、car的连接基序可以是相对稳定的结构域(例如igg的恒定结构域)或被设计成延伸的柔性接头。结构基序(例如来源于igg恒定结构域的那些)可用于将scfv结合结构域延伸远离t细胞质膜表面。这对于一些其中结合结构域与肿瘤细胞表面膜特别接近的肿瘤靶标而言可以是重要的(例如对于二唾液酸神经节苷脂gd2而言；orentas et al.，未发表的观察结果)。迄今为止，用于car的信号传导基序总是包含cd3-ζ链，因为该核心基序是t细胞活化的关键信号。首次报道的第二代car以cd28信号传导结构域和cd28跨膜序列为特征。该基序还用于包含cd137(4-1bb)信号传导基序的第三代car中(zhao y et al jimmunol.2009；183(9):5563–74)。随着新技术的出现，用与抗cd3和抗cd28抗体连接的珠活化t细胞，以及来自cd28的典型“信号2”的存在不再需要由car自身编码。通过使用珠活化，发现在体外测定中第三代载体并不优于第二代载体，并且在白血病的小鼠模型中其相对于第二代载体并未提供明显的益处(haso w,lee dw,shah nn,stetler-stevenson m,yuancm,pastan ih,dimitrov ds,morgan ra,fitzgerald dj,barrett dm,wayne as,mackallcl,orentas rj.anti-cd22-chimeric antigen receptors targeting bcell precursoracute lymphoblastic leukemia,blood.2013；121(7):1165–74；kochenderfer jn etal.blood.2012；119(12):2709–20)。这通过第二代cd28/cd3-ζ(lee dw et al.americansociety ofhematology annual meeting.new orleans,la；december 7-10,2013)和cd137/cd3-ζ信号传导形式(porter dlet al.n engl j med.2011；365(8):725–33)的cd19特异性car的临床成功得到证实。除cd137之外，其他肿瘤坏死因子受体超家族成员(例如ox40)也能够在car转导t细胞中提供重要的持续信号(yvon e et al.clin cancerres.2009；15(18):5852–60)。同样重要的是培养car t细胞群的培养条件，例如包含细胞因子il-2、il-7和/或il-15(kaiser ad et al.cancer gene ther.2015；22(2):72-78)。
7、目前用于癌症的car治疗的更广泛且有效的适应中的挑战与有力靶标的缺乏相关。建立细胞表面抗原的结合物现今是可容易实现的，但发现对肿瘤具有特异性同时不伤害正常组织的细胞表面抗原仍然是艰巨的挑战。赋予car表达t细胞以更大靶细胞特异性的一种潜在方式是使用组合的car方法。在一种系统中，将cd3-ζ和cd28信号单元在同一细胞中表达的两种不同car构建体之间分开；在另一种系统中，在同一t细胞中表达两种car，但一种具有较低的亲和力并因此需要另一种car首先进行接合(engage)以使第二者具有完全活性(lanitis e et al.cancer immunol res.2013；1(1):43–53；kloss cc et al.natbiotechnol.2013；31(1):71–5)。产生基于单scfv的car作为免疫治疗剂的第二挑战是肿瘤细胞异质性。至少一个团队已开发了用于胶质母细胞瘤的car策略，其中效应细胞群同时靶向多种抗原(her2、il-13ra、epha2)，希望避免靶抗原阴性群的结果(hegde m et al.molther.2013；21(11):2087–101)。
8、基于t细胞的免疫治疗已经成为合成生物学中的新前沿；预见多种启动子和基因产物将这些高度强效的细胞引导至肿瘤微环境，在此t细胞不但可以避开负调节信号而且还可以介导有效的肿瘤杀伤。通过用基于化学的二聚体(例如ap1903)进行诱导型胱天蛋白酶9(caspase 9)构建体的药物诱导二聚化来消除不期望的t细胞，表明其中可在药理学上开启可控制t细胞群的强大开关的一种方式(di stasi aet al.n engl j med.2011；365(18):1673–83)。通过诱饵受体的表达产生对转化生长因子β的负调节效应具有免疫的效应t细胞群进一步表明针对最佳抗肿瘤活性可对效应t细胞进行改造的程度(foster ae etal.j immunother.2008；31(5):500–5)。因此，虽然看起来car可以以类似于内源性t细胞受体的方式触发t细胞活化，但迄今为止该技术的临床应用的主要障碍受限于car+t细胞的体内扩增、输注之后细胞的迅速消失和令人失望的临床活性。这可部分地归因于所采用的一些car序列的鼠来源。
9、对于接受该治疗的重症患者，使用博纳吐单抗(blinotumomab)(双特异性抗cd19和抗cd3抗体)已显示出令人印象深刻的结果。然而持久缓解率小于40％，并且最多只有50％的应答者可被造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplant，hsct)挽救(参见gore et al.,2014,nct01471782和von stackelberg,et al.,2014,nct01471782，在benjamin,je,stein as,2016,therapeutic advances in hematology 7:142-156中进行了概述)。已接受双特异性抗体或car-t治疗的患者随后进行hsct以维持持久应答的要求仍是积极争论的领域。尽管报道了cd19 car-t试验的高度响应，一些甚至大于90％，但如果将试验重塑为“意图治疗”试验，则该数字可更接近70％(davis kl,mackall cl,2016,bloodadvances1:265-268)。报道的在car19治疗之后12个月的最佳结果显示，在宾夕法尼亚大学(the university of pennsylvania)能够接受t细胞产品的患者中，rfs为55％并且os为79％(maude sl,teachey dt,rheingold sr,shaw pa,aplenc r,barrett dm,barker cs,callahan c,frey nv,farzana n,lacey sf,zheng a,levine b,melenhorst jj,motleyl,prter dl,june ch,grupp sa,2016,j clin oncol 34,no15_suppl(may 2016)3011-3011)。
10、因此，本领域中迫切且长期需要找到使用可表现出特异性和有效抗肿瘤作用而没有前述缺点的方法用于治疗b-all和其他表达cd19的b细胞恶性肿瘤的新的组合物和方法。
11、本发明通过提供可用于治疗癌症和其他疾病和/或病症的car组合物和治疗方法而解决了这些需求。特别地，如本文中所公开和描述的本发明提供了以下car：其可用于治疗与cd19表达失调相关的疾病、障碍或病症，并且所述car包含cd19抗原结合结构域，其在经转导t细胞上表现出高表面表达、表现出表达cd19细胞的高度细胞裂解，并且其中经转导t细胞示出体内扩增和持续性。
技术实现思路
1、本文中提供了包含这样的cd19抗原结合结构域的新的抗cd19抗体或其抗原结合结构域以及嵌合抗原受体(car)，以及表达所述受体的宿主细胞(例如，t细胞)，以及编码所述受体的核酸分子。所述car在经转导t细胞上表现出高表面表达，并且在体内具有高度的细胞裂解以及经转导t细胞扩增和持续性。还提供了使用所公开的car、宿主细胞和核酸分子的方法，例如以在对象中治疗癌症。
2、因此，在一方面中，提供了编码人抗cd19抗体或其片段的分离的多核苷酸，其包含选自seq id no:1、3、5、7、9、11、13和15的核酸序列。
3、在一个实施方案中，提供了编码完全人抗cd19抗体或其片段的分离的多核苷酸，其中所述抗体或其片段包含选自fab片段、f(ab’)2片段、fv片段和单链fv(scfv)的片段。
4、在一个实施方案中，提供了编码完全人抗cd19抗体或其片段的分离的多核苷酸，其中所述抗体或其片段包含选自seq id no:2、4、6、8、10、12、14和16的氨基酸序列。
5、在一方面中，提供了编码嵌合抗原受体(car)的分离的核酸分子，所述嵌合抗原受体从n端到c端包含至少一个cd19抗原结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域，所述cd19抗原结合结构域由包含选自seq id no:1、3、5、7、9、11、13和15的核酸序列的核苷酸序列编码。
6、在一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中所编码的胞外cd19抗原结合结构域包含与cd19结合的抗体的至少一个单链可变片段。
7、在另一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中所编码的胞外cd19抗原结合结构域包含与cd19结合的抗体的至少一个重链可变区。
8、在另一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中所编码的car胞外cd19抗原结合结构域还包含至少一个与cd19结合的基于脂质运载蛋白(lipocalin)的抗原结合抗原(抗运载蛋白(anticalin))。
9、在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的胞外cd19抗原结合结构域通过接头结构域与跨膜结构域连接。
10、在另一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中在编码的cd19胞外抗原结合结构域之前是编码前导或信号肽的序列。
11、在另一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，所述car包含由含有选自seq id no:1、3、5、7、9、11、13和15的核酸序列的核苷酸序列编码的至少一个cd19抗原结合结构域，并且其中car另外编码靶向包括但不限于以下抗原的胞外抗原结合结构域：cd20、cd22、ror1、间皮素、cd33、cd38、cd123(il3ra)、cd138、bcma(cd269)、gpc2、gpc3、fgfr4、c-met、psma、糖脂f77、egfrviii、gd-2、tslpr、ny-eso-1tcr、mage a3 tcr，或其任意组合。
12、在某些实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中另外的所编码的胞外抗原结合结构域包含抗cd20 scfv抗原结合结构域、抗cd22 scfv抗原结合结构域、抗ror1scfv抗原结合结构域、抗间皮素scfv抗原结合结构域、抗cd33 scfv抗原结合结构域、抗cd38 scfv抗原结合结构域、抗cd123(il3ra)scfv抗原结合结构域、抗cd138 scfv抗原结合结构域、抗bcma(cd269)scfv抗原结合结构域、抗gpc2 scfv抗原结合结构域、抗gpc3 scfv抗原结合结构域、抗fgfr4 scfv抗原结合结构域、抗tslpr scfv抗原结合结构域、抗c-metscfv抗原结合结构域、抗pmsascfv抗原结合结构域、抗糖脂f77 scfv抗原结合结构域、抗egfrviii scfv抗原结合结构域、抗gd-2scfv抗原结合结构域、抗ny-eso-1tcr scfv抗原结合结构域、抗mage a3 tcr scfv抗原结合结构域，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其任意组合。
13、在一方面中，本文中提供的car还包含接头或间隔区结构域(spacer domain)。
14、在一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中所述胞外cd19抗原结合结构域、所述胞内信号传导结构域或这二者通过接头或间隔区结构域与所述跨膜结构域连接。
15、在一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中所编码的接头结构域来源于cd8或cd28的胞外结构域，并且与跨膜结构域连接。
16、在另一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中所编码的car还包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包含选自以下的蛋白质的跨膜结构域：t细胞受体的α、β或ζ链；cd28；cd3ε；cd45；cd4；cd5；cd8；cd9；cd16；cd22；cd33；cd37；cd64；cd80；cd83；cd86；cd134；cd137和cd154；或其组合。
17、在另一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中所编码的胞内信号传导结构域还包含cd3ζ胞内结构域。
18、在一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中所编码的胞内信号传导结构域相对于cd3ζ胞内结构域布置在n端侧。
19、在另一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个胞内信号传导结构域包含共刺激结构域、初级信号传导结构域(primary signalingdomain)，或其组合。
20、在另一些实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个共刺激结构域包含以下的功能性信号传导结构域：ox40、cd70、cd27、cd28、cd5、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、dap10、dap12和4-1bb(cd137)，或其组合。
21、在一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其还包含前导序列或信号肽，其中前导或信号肽核苷酸序列包含seq id no:17的核苷酸序列。
22、在另一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中所编码的前导序列包含seq id no:18的氨基酸序列。
23、在一方面中，本文中提供了嵌合抗原受体(car)，其从n端到c端包含至少一个cd19抗原结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域。
24、在一个实施方案中，提供了car，其中所述胞外cd19抗原结合结构域包含与抗原结合的抗体的至少一个单链可变片段、或与抗原结合的抗体的至少一个重链可变区，或其组合。
25、在另一个实施方案中，提供了car，其中所述至少一个跨膜结构域包含选自以下的蛋白质的跨膜结构域：t细胞受体的α、β或ζ链；cd28；cd3ε；cd45；cd4；cd5；cd8；cd9；cd16；cd22；cd33；cd37；cd64；cd80；cd86；cd134；cd137；cd154；tnfrsf19；或其组合。
26、在一些实施方案中，提供了car，其中car另外编码包含以下的胞外抗原结合结构域：cd20、cd22、ror1、间皮素、cd33、cd38、cd123(il3ra)、cd138、bcma(cd269)、gpc2、gpc3、fgfr4、tslpr、c-met、psma、糖脂f77、egfrviii、gd-2、tslpr、ny-eso-1tcr、mage a3 tcr，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其任意组合。
27、在一个实施方案中，提供了car，其中所述胞外抗原结合结构域包含抗cd20 scfv抗原结合结构域、抗cd22 scfv抗原结合结构域、抗ror1scfv抗原结合结构域、抗间皮素scfv抗原结合结构域、抗cd33 scfv抗原结合结构域、抗cd38 scfv抗原结合结构域、抗cd123(il3ra)scfv抗原结合结构域、抗cd138 scfv抗原结合结构域、抗bcma(cd269)scfv抗原结合结构域、抗gpc2 scfv抗原结合结构域、抗gpc3 scfv抗原结合结构域、抗fgfr4 scfv抗原结合结构域、抗tslpr scfv抗原结合结构域、抗c-met scfv抗原结合结构域、抗pmsascfv抗原结合结构域、抗糖脂f77 scfv抗原结合结构域、抗egfrviii scfv抗原结合结构域、抗gd-2scfv抗原结合结构域、抗ny-eso-1tcr scfv抗原结合结构域、抗mage a3 tcrscfv抗原结合结构域，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其任意组合。
28、在另一个实施方案中，提供了car，其中至少一个胞内信号传导结构域包含共刺激结构域和初级信号传导结构域。
29、在另一个实施方案中，提供了car，其中至少一个胞内信号传导结构域包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包含选自以下的蛋白质的功能性信号传导结构域：ox40、cd70、cd27、cd28、cd5、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、dap10、dap12和4-1bb(cd137)，或其组合。
30、在一个实施方案中，编码car的核酸序列包含seq id no:19的核酸序列(ltg2050lp-m19217-cd8 tm-41bb-cd3ζcar核酸序列(图2a))。在一个实施方案中，该核酸序列编码包含seq id no:20的氨基酸序列(ltg 2050lp-m19217-cd8 tm-41bb-cd3ζcar氨基酸序列(图2a))的car。
31、在另一个实施方案中，编码car的核酸序列包含seq id no:21的核酸序列(ltg2065lp-m19217-1-cd8 tm-41bb-cd3ζcar核酸序列(图2b))。在一个实施方案中，该核酸序列编码包含seq id no:22的氨基酸序列(ltg 2065lp-m19217-1-cd8 tm-41bb-cd3ζcar氨基酸序列(图2b))的car。
32、在另一个实施方案中，编码car的核酸序列包含seq id no:23的核酸序列(ltg2066 lp-m19217-2-cd8 tm-41bb-cd3ζcar核苷酸序列(图2c))。在一个实施方案中，该核酸序列编码包含seq id no:24的氨基酸序列(ltg 2066lp-m19217-2-cd8 tm-41bb-cd3ζcar氨基酸序列(图2c))的car。
33、在另一个实施方案中，编码car的核酸序列包含seq id no:25的核酸序列(ltg2067lp-m19217-7-cd8 tm-41bb-cd3ζcar核酸序列(图2d))。在一个实施方案中，该核酸序列编码包含seq id no:26的氨基酸序列(ltg 2067lp-m19217-7-cd8 tm-41bb-cd3ζcar氨基酸序列(图2d))的car。
34、在另一个实施方案中，编码car的核酸序列包含seq id no:27的核酸序列(ltg2068lp-m19217-23-cd8 tm-41bb-cd3ζcar核酸序列(图2e))。在一个实施方案中，该核酸序列编码包含seq id no:28的氨基酸序列(ltg2068 lp-m19217-23-cd8 tm-41bb-cd3ζcar氨基酸序列(图2e))的car。
35、在另一个实施方案中，编码car的核酸序列包含seq id no:29的核酸序列(ltg2069lp-m19217-29-cd8 tm-41bb-cd3ζcar核酸序列(图2f))。在一个实施方案中，该核酸序列编码包含seq id no:30的氨基酸序列(ltg 2069lp-m19217-29-cd8 tm-41bb-cd3ζcar氨基酸序列(图2f))的car。
36、在另一个实施方案中，编码car的核酸序列包含seq id no:31的核酸序列(ltg2070lp-m19217-38-cd8 tm-41bb-cd3ζcar核酸序列(图2g))。在一个实施方案中，该核酸序列编码包含seq id no:32的氨基酸序列(ltg 2070lp-m19217-38-cd8 tm-41bb-cd3ζcar氨基酸序列(图2g))的car。
37、在另一个实施方案中，编码car的核酸序列包含seq id no:33的核酸序列(ltg2071lp-m19217-40-cd8 tm-41bb-cd3ζcar核酸序列(图2h))。在一个实施方案中，该核酸序列编码包含seq id no:34的氨基酸序列(ltg 2071lp-m19217-40-cd8 tm-41bb-cd3ζcar氨基酸序列(图2h))的car。
38、在一方面中，本文中所公开的car被修饰以表达或包含可检测标志物，以用于诊断、监测、和/或预测治疗结果(例如癌症患者的无进展存活)或用于监测这样的治疗的进展。
39、在一个实施方案中，编码所公开car的核酸分子可包含在载体(例如病毒载体)中。载体是dna载体、rna载体、质粒载体、黏粒载体、疱疹病毒载体、麻疹病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体，或其组合。
40、在某些实施方案中，所述载体还包含启动子，其中所述启动子是诱导型启动子、组织特异性启动子、组成型启动子、自杀型启动子或其任意组合。
41、在另一个实施方案中，表达car的载体还可被修饰以包含一个或更多个控制car t细胞表达或借助自杀开关来消除car-t细胞的操纵元件。自杀开关可包括例如凋亡诱导性信号传导级联反应或诱导细胞死亡的药物。在一个优选实施方案中，表达car的载体还可被修饰以表达酶，例如胸苷激酶(thymidine kinase，tk)或胞嘧啶脱氨酶(cytosinedeaminase，cd)。
42、在另一方面中，还提供了包含编码car的核酸分子的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是t细胞，例如从对象中获得的原代t细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞是cd8+t细胞。
43、在另一方面中，提供了包含抗肿瘤有效量的人t细胞群的药物组合物，其中所述t细胞包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸序列，其中所述car包含至少一个胞外抗原结合结构域、至少一个接头结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域，所述胞外抗原结合结构域包含含有seq id no.2、4、6、8、10、12、14或16的氨基酸序列的人cd19抗原结合结构域，其中所述t细胞是患有癌症的人的t细胞。所述癌症尤其包括血液系统癌症(hematological cancer)，例如白血病(例如慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocyticleukemia，cll)、急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia，all)或慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia，cml)、淋巴瘤(例如，套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin's lymphoma)或霍奇金淋巴瘤(hodgkin'slymphoma))或多发性骨髓瘤，或其组合。
44、在一个实施方案中，提供了药物组合物，其中car的至少一个跨膜结构域包含选自以下的蛋白质的跨膜结构域：t细胞受体的α、β或ζ链；cd28；cd3ε；cd45；cd4；cd5；cd8；cd9；cd16；cd22；间皮素；cd33；cd37；cd64；cd80；cd83；cd86；cd134；cd137；cd154；tnfrsf19；或其组合。
45、在另一个实施方案中，提供了药物组合物，其中人癌症包括成人癌(adultcarcinoma)，其包括口腔和咽癌(舌、口、咽、头和颈)、消化系统癌症(食管、胃、小肠、结肠、直肠、肛门、肝、肝内胆管、胆囊、胰腺)、呼吸系统癌症(喉、肺和支气管)、骨和关节癌、软组织癌、皮肤癌(黑素瘤、基底细胞和鳞状细胞癌)、儿童肿瘤(神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤(ewing’s sarcoma))、中枢神经系统肿瘤(脑、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、胶质瘤)，以及乳腺癌、生殖系统癌症(子宫颈、子宫体、卵巢、外阴、阴道、前列腺、睾丸、阴茎、子宫内膜)、泌尿系统癌症(膀胱、肾和肾盂、输尿管)、眼癌和眶(orbit)癌、内分泌系统癌症(甲状腺)，以及脑癌和其他神经系统癌症，或其任意组合。
46、在另一个实施方案中，提供了包含抗肿瘤有效量的患有癌症之人的人t细胞群的药物组合物，其中所述癌症是对一种或更多种化学治疗剂不具有响应性的难治性癌症。所述癌症包括造血系统癌症、骨髓增生异常综合征胰腺癌、头颈癌、皮肤肿瘤、以下中的微小残留病(minimal residual disease，mrd)：急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓细胞性白血病(acute myeloid leukemia，aml)、成人b细胞恶性肿瘤(包括cll(慢性淋巴细胞白血病)、cml(慢性髓细胞性白血病)、非霍奇金淋巴瘤(nhl))、儿童b细胞恶性肿瘤(包括b谱系all(急性淋巴细胞白血病))、多发性骨髓瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、黑素瘤或其他血液系统癌症和实体瘤，或其任意组合。
47、在另一方面中，提供了制备包含car的t细胞(下文中“car-t细胞”)的方法。所述方法包括用编码特异性结合cd19的所公开car的载体或核酸分子转导t细胞，从而制备car-t细胞。
48、在另一方面中，提供了产生rna经改造的细胞群的方法，其包括将编码所公开的car的核酸分子的体外转录rna或合成rna引入对象的细胞内，从而产生表达car的细胞。
49、在另一方面中，提供了用于诊断与细胞上cd19表达相关的疾病、障碍或病症的方法，其包括a)使细胞与人抗cd19抗体或其片段接触，其中所述抗体或其片段包含选自seqid no:2、4、6、8、10、12、14、16的氨基酸序列；以及b)检测cd19的存在，其中cd19的存在诊断与cd19表达相关的疾病、障碍或病症。
50、在一个实施方案中，与cd19表达相关的疾病、障碍或病症是癌症，其包括造血系统癌症、骨髓增生异常综合征胰腺癌、头颈癌、皮肤肿瘤、以下中的微小残留病(minimalresidual disease，mrd)：急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓细胞性白血病(aml)、成人b细胞恶性肿瘤(包括cll(慢性淋巴细胞白血病)、cml(慢性髓细胞性白血病)、非霍奇金淋巴瘤(nhl))、儿童b细胞恶性肿瘤(包括b谱系all(急性淋巴细胞白血病))、多发性骨髓瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、黑素瘤或其他血液系统癌症和实体瘤，或其任意组合。
51、在另一个实施方案中，提供了诊断、预后或确定哺乳动物中与cd19相关疾病风险的方法，其包括检测来源于哺乳动物的样品中cd19的表达，包括：a)使样品与人抗cd19抗体或其片段接触，其中所述抗体或其片段包含选自seq id no:2、4、6、8、10、12、14或16的氨基酸序列；以及b)检测cd19的存在，其中cd19的存在诊断哺乳动物中与cd19相关疾病。
52、在另一个实施方案中，提供了抑制cd19依赖性t细胞抑制的方法，其包括使细胞与人抗cd19抗体或其片段接触，其中所述抗体或其片段包含选自seq id no:2、4、6、8、10、12、14或16的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞选自表达cd19的肿瘤细胞、肿瘤相关巨噬细胞，及其任意组合。
53、在另一个实施方案中，提供了阻断由表达cd19的细胞介导的t细胞抑制和改变肿瘤微环境以抑制哺乳动物中的肿瘤生长的方法，其包括向哺乳动物施用有效量的包含分离的抗cd19抗体或其片段的组合物，其中所述抗体或其片段包含选自seq id no:2、4、6、8、10、12、14和16的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述细胞选自表达cd19的肿瘤细胞、肿瘤相关巨噬细胞，及其任意组合。
54、在另一个实施方案中，提供了抑制、阻止或预防哺乳动物中抗肿瘤或抗癌免疫应答的免疫抑制的方法，其包括向哺乳动物施用有效量的包含分离的抗cd19抗体或其片段的组合物，其中所述抗体或其片段包含选自seq id no:2、4、6、8、10、12、14和16的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗体或其片段抑制第一细胞与t细胞之间的相互作用，其中所述第一细胞选自表达cd19的肿瘤细胞，肿瘤相关巨噬细胞，及其任意组合。
55、在另一方面中，提供了用于在哺乳动物中诱导抗肿瘤免疫的方法，其包括向哺乳动物施用治疗有效量的用编码所公开的car的载体或核酸分子转导的t细胞。
56、在另一个实施方案中，提供了在哺乳动物中治疗或预防癌症的方法，其包括以在哺乳动物中有效治疗或预防癌症的量向哺乳动物施用一种或更多种所公开的car。该方法包括在以下条件下向对象施用治疗有效量的表达特异性结合cd19和/或前述一种或更多种抗原的所公开的car的宿主细胞，所述条件足以在所述对象中使得car上的抗原结合结构域与cd19和/或前述一种或更多种抗原的胞外结构域形成免疫复合物。
57、在另一个实施方案中，提供了用于治疗患有与肿瘤抗原表达升高相关的疾病、障碍或病症的哺乳动物的方法，所述方法包括向对象施用包含抗肿瘤有效量的t细胞群的药物组合物，其中所述t细胞包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸序列，其中所述car包含至少一个胞外cd19抗原结合结构域、至少一个接头或间隔区结构域、至少一个跨膜结构域、至少一个胞内信号传导结构域，所述胞外cd19抗原结合结构域包含seq idno.2、4、6、8、10、12、14或16的氨基酸序列，或其任意组合，并且其中所述t细胞是患有癌症的对象的t细胞。
58、在另一个实施方案中，提供了用于在有此需要的对象中治疗癌症的方法，其包括向所述对象施用包含抗肿瘤有效量的t细胞群的药物组合物，其中所述t细胞包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸序列，其中所述car包含至少一个cd19抗原结合结构域、至少一个接头或间隔区结构域、至少一个跨膜结构域、至少一个胞内信号传导结构域，所述cd19抗原结合结构域包含seq id no.2、4、6、8、10、12、14或16的氨基酸序列，或其任意组合，其中所述t细胞是患有癌症的对象的t细胞。在前述方法的一些实施方案中，所述至少一个跨膜结构域包含选自以下的蛋白质的跨膜结构域：t细胞受体的α、β或ζ链；cd28；cd3ε；cd45；cd4；cd5；cd8；cd9；cd16；cd19；cd22；间皮素；cd33；cd37；cd64；cd80；cd83；cd86；cd134；cd137；cd154；tnfrsf16；tnfrsf19；或其组合。
59、在另一个实施方案中，提供了用于在被诊断患有癌症的人中产生持续性经遗传改造t细胞群的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向人施用经遗传改造为表达car的t细胞，其中所述car包含至少一个cd19抗原结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域，所述cd19抗原结合结构域包含seq id no.2、4、6、8、10、12、14或16的氨基酸序列，或其任意组合，其中在施用之后，所述持续性经遗传改造t细胞群或所述t细胞的子代群在人体内持续存在至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、2年或3年。
60、在一个实施方案中，人中的子代t细胞包含记忆t细胞。在另一个实施方案中，t细胞是自体t细胞。
61、在本文中所述的所有方法的方面和实施方案中，均可使用本文中所公开的一种或更多种car来治疗或预防或改善与肿瘤抗原的表达升高相关的任何前述癌症、疾病、障碍或病症。
62、在另一方面中，提供了用于制备如上所述的嵌合抗原受体t细胞或用于如上所述在对象中预防、治疗或改善任何与肿瘤抗原表达升高相关的癌症、疾病、障碍或病症的药盒(kit)，其包含容器和用于使用该药盒的说明书，所述容器包含上文中所公开的核酸分子、载体、宿主细胞或组合物的任一种或其任意组合。
63、应理解，car、宿主细胞、核酸和方法在本文中详细描述的特定方面和实施方案之外也是可用的。本公开内容的前述特征和优点将从以下详细描述变得更明显，该详细描述通过参考附图来进行。
1.编码嵌合抗原受体(car)的分离的核酸分子，其中所述car包含seq id no:20、22、24、26、28、30、32或34的氨基酸序列。
2.由权利要求1所述的分离的核酸分子编码的嵌合抗原受体(car)。
3.药物组合物，其包含分离的人t细胞群，其中所述分离的人t细胞包含编码权利要求2所述的嵌合抗原受体(car)的核酸序列，并且其中所述分离的人t细胞分离自患有癌症的人。
4.权利要求3所述的药物组合物，其中所述癌症是血液系统癌症。
5.权利要求4所述的药物组合物，其中所述血液系统癌症是白血病或淋巴瘤。
6.权利要求5所述的药物组合物，其中所述白血病为慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴细胞白血病(all)或慢性髓细胞性白血病(cml)。
7.权利要求5所述的药物组合物，其中所述淋巴瘤为套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤。
8.权利要求4所述的药物组合物，其中所述血液系统癌症为多发性骨髓瘤。
9.权利要求3所述的药物组合物，其中所述癌症选自口腔和咽癌、消化系统癌症、呼吸系统癌症、骨和关节癌、软组织癌、皮肤癌、中枢神经系统癌症、乳腺癌、生殖系统癌症、泌尿系统癌症、眼癌和眶癌、内分泌系统癌症和脑癌。
10.载体，其包含权利要求1所述的核酸分子。
11.权利要求10所述的载体，其中所述载体选自dna载体、rna载体、质粒载体、黏粒载体、疱疹病毒载体、麻疹病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体及其组合。
12.权利要求10所述的载体，其还包含启动子。
13.权利要求12所述的载体，其中所述启动子是诱导型启动子、组成型启动子、组织特异性启动子、自杀型启动子或其任意组合。
14.分离的细胞，其包含权利要求10所述的载体。
15.权利要求14所述的分离的细胞，其中所述分离的细胞是t细胞。
16.权利要求14所述的分离的细胞，其中分离的t细胞是cd8+t细胞。
17.权利要求14所述的分离的细胞，其中所述分离的细胞是人细胞。
