本发明属于生物医药领域，涉及仿生金属酶，特别是指一种以聚酰胺衍生物为内核的仿生金属酶及其制备方法和应用。
背景技术：
1、近年来，细胞内催化引起了越来越多的关注，因为它为直接控制生物化学过程或产生细胞中感兴趣的分子提供了一种简单而有效的方法。为了获得增强的功能，并实现细胞中催化的有用性，最好能扩大使用这些细胞内催化剂的“可催化”反应的范围，从而实现更多的非生物转化。然而，大多数具有催化性能的金属配合物在生物相关的条件下表现出活性降低甚至完全失活，因为在这种环境中配位生物分子被毒化。广泛采用的一种解决方案是引入人工支架，如单链纳米粒子(scnps)，致密壳纳米粒子(dsnps)，蛋白质和无机纳米材料，为那些催化金属复合物。这些细胞内的催化策略已经成功地带来了更多的催化物种进入细胞；但伴随的问题，如细胞毒性，低细胞摄取，困难的金属支架组装，和有限的保护效果的金属中心仍然经常阻碍他们的应用。
2、胞内仿生金属酶在生物催化和医学应用方面显示出巨大的潜力，但其在实际应用中仍然面临多重挑战。本技术发明人前期针对snas在胞内催化的可能性进行探索，但是在动物模型中催化效果并不理想(molecularly pure miktoarm spherical nucleic acids:preparation and usage as a scaffold for abiotic intracellular catalysis)；发明人进一步总结经验，发现仿生金属酶中仍存在以下问题：
3、第一：是细胞内复杂的生物环境对仿生金属酶的稳定性造成了显著影响，使其失活。特别是金属离子在胞内可能受到其他竞争配位体的干扰，导致酶的活性下降或失活。
4、第二：胞内仿生金属酶在进入细胞内部时需要克服生物膜的屏障。
5、第三：胞内仿生金属酶的催化效率常常在复杂的生物体系中受到限制。
6、第四：仿生金属酶中金属离子的泄露造成其对细胞的潜在毒性也是一个关键考量因素。游离的重金属离子在细胞中若过量或过于活跃，可能引起细胞毒性反应，包括氧化应激、蛋白质功能障碍和膜损伤。
7、第五：长时间作用可能带来的免疫原性反应也是需关注的重点。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本发明提出一种以聚酰胺衍生物为内核的仿生金属酶及其制备方法和应用。
2、本发明的技术方案是这样实现的：
3、一种以聚酰胺衍生物为内核的仿生金属酶的制备方法，步骤为：
4、(1)alkyl-pamam内核的合成
5、
6、以丙炔酸为原料，在溶剂二氯甲烷或dmf中，使用羟基琥珀酰亚胺在三乙胺和二环己基碳二亚胺的催化下对羧基进行活化，得到琥珀酰亚胺的活化酯(化合物1)，丙炔酸、羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺和三乙胺的当量比为1:1:1.5:1.5；再使用过量的化合物1(100equiv.)与三代外层含有16个氨基臂的pamam-nh2(1.0equiv.)在三乙胺的催化下在超干甲醇体系或超干乙醇体系中反应3～7天，得到端炔修饰的超支化聚酰胺衍生物alkyl-pamam(化合物2)作为内核分子。
7、其中pamam-nh2的cas号为153891-46-4。
8、alkyl-pamam的结构为：
9、
10、(2)pamam-sna的合成
11、
12、称取19.8-90.2mg的化合物2(5-21μmol,1.0equiv.)溶解在5～10ml的dmf，加入25ml具磁子的圆底烧瓶中。将108.8-456.2mg(31-130μmol,6.2equiv.)叠氮三唑配体(azido-tris(triazole，azido-tta)溶解在2-5ml的dmf中，溶解彻底后加入上述体系，通ar气体。称取5.85-24.6mg(32.5-136.5μmol,6.5equiv.)的无水cuso4和17.0-72.4mg(32.5-136.5μmol,6.5equiv.)的tbta配体(cas no.:510758-28-8)混合溶解在1-5ml的dmf中，混合后静置5min，然后将溶液打入ar氛围保护的烧瓶体系中，室温中速搅拌反应两天。两天以后，向体系中加入负载了n3-dna链(负载的dna量为77.5-325.5μmol,15.5equiv.)的cpg玻璃珠。称取10.4-43.5mg(57.5-241.5μmol,11.5equiv.)的无水cuso4和30.5-128.1mg(11.5equiv.)的tbta配体混合溶解在2-10ml的dmf中，混合后静置5min，然后打入上述反应体系。体系维持氩气保护氛围，室温下高速搅拌反应7天。反应完成后，将反应体系抽滤留滤渣(cpg玻璃珠)，抽滤下将cpg玻璃珠用乙腈淋洗5-7次，抽干液体后用氮气吹干。
13、其中：n3-dna链的序列如seq id no.1所示：
14、5’-n3-ttttttttttttttttttttggtggtggtggttgtggtggtggtggt-3’。
15、(3)pamam-sna的纯化
16、将步骤(2)获得的cpg玻璃珠放入棕色样品瓶中，加入1-5ml氨水后盖盖密封，室温放置24h。然后用氮气将多余氨气吹走，切下的未反应的dna及碎片和sna目标产物的混合物用rp-hplc进行分离提纯，即可得到sna纯品，再将溶液冻干得到sna冻干粉末，-20℃条件下可以长期(＞2年)储存。
17、本技术制备的仿生金属酶其具有以下结构通式：
18、
19、式中：
20、r为tbta的络合物，其结构式为：
21、为n3-dna链：5’-n3-ttttttttttttttttttttggtggtggtggttgtggtggtggtggt-3’。
22、上述的仿生金属酶在制备胞内催化剂中的应用。
23、上述的仿生金属酶在制备催化点击反应的试剂中的应用。
24、本发明具有以下有益效果：
25、1、本技术制备了一种具有靶向性、高生物安全性和低免疫原性的核壳结构的核酸-聚酰胺高分子催化剂。在该体系中，催化活性中心被外层致密的核酸外壳保护，同时利用超支化聚合物聚酰胺确定的分子结构和疏水性质，将内部营造出一种高度“纯净”的催化环境，避免了仿生酶在复杂体系中失活的困境，同时也避免了金属离子在体内的泄露隐患。利用材料的立体结构，通过识别作用可以自主进入细胞，避免了高毒性的阳离子转染剂的使用。解决了仿生金属酶目前面临的一些较为主要的问题。
26、2、本技术的仿生金属酶具有立体结构的多价核酸偶联物可以将催化活性中心良好的包裹在材料内部，保证其在复杂环境中的催化活性；在材料外层修饰特定序列的多价核酸为致密外壳，形成具有特殊立体结构的球形核酸纳米结构。无论是聚酰胺还是核酸材料的生物相容性都很高。同时由于外层修饰了致密的带负电荷的核酸外层，使得发明的材料对于内核的铜离子的保护作用十分显著，保持其体内良好的催化活性的同时，也很好的解决了金属离子的泄露风险。利用外层核酸的识别作用，可以高效的高靶向性的进入目标细胞，且外层核酸序列可定制，仅通过替换核酸链的序列(j.am.chem.soc.2020,142,31,13350-13355.或adv.sci.2024,11,2308924.)，就可以实现靶向不同细胞并向其递送仿酶催化剂的目的，方法简便、可靠性高；
27、3、本技术的利用核壳结构，实现对内部金属离子的“束缚”，极大地提高了材料的生物安全性；材料的主要成分核酸单链也为生物相容性极高的材料。因此，这种以聚酰胺衍生物为内核的多价核酸偶联物能够在体内复杂的生化环境中，高效催化点击反应，是一种具有开发潜力的胞内仿生金属酶。
1.一种以聚酰胺衍生物为内核的仿生金属酶的制备方法，其特征在于，步骤为：
2.根据权利要求1所述的以聚酰胺衍生物为内核的仿生金属酶的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中丙炔酸、羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺和三乙胺的当量比为1:1:1.5:1.5；化合物1、pamam-nh2和三乙胺的当量比为80-120:1:20；有机溶剂ⅰ为二氯甲烷或dmf；有机溶剂ⅱ为超干甲醇或超干乙醇。
3.根据权利要求2所述的以聚酰胺衍生物为内核的仿生金属酶的制备方法，其特征在于：所述活化反应的温度为0-25℃、时间为4-8h；继续反应的时间为3-7天。
4.根据权利要求1所述的以聚酰胺衍生物为内核的仿生金属酶的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中n3-dna链的序列如seq id no.1所示，其5’端连接有n3-基团。
5.根据权利要求4所述的以聚酰胺衍生物为内核的仿生金属酶的制备方法，其特征在于：所述alkyl-pamam、叠氮三唑配体、无水cuso4和n3-dna链的当量比为1:6.2:18:18:15.5。
6.根据权利要求5所述的以聚酰胺衍生物为内核的仿生金属酶的制备方法，其特征在于：所述室温搅拌的时间为2-3天，高速搅拌反应的时间为5-7天。
7.根据权利要求6所述的以聚酰胺衍生物为内核的仿生金属酶的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中密封放置的时间为24h。
8.利用权利要求1-7任一项所述的方法制备的仿生金属酶，其具有以下结构通式：；
9.权利要求8所述的仿生金属酶在制备胞内催化剂中的应用。
10.权利要求8所述的仿生金属酶在制备催化点击反应的试剂中的应用。
