本发明涉及分子生物学技术，更具体地，涉及子宫基质特异性基因编辑小鼠的构建方法。
背景技术：
1、子宫基质细胞是存在于子宫内膜基质中的细胞，基质层是内膜中提供支撑和营养的部分。子宫内膜由两层构成：上皮层(表层细胞)和基质层(支撑细胞)。基质细胞主要参与内膜的再生和重塑，特别是在月经周期和妊娠期间发挥重要作用。子宫基质细胞在调节子宫内膜的功能、支持胚胎植入及维持妊娠等方面具有关键作用，理解这些细胞的功能对于妇科疾病的诊断和治疗具有重要意义。
2、vimentin是编码中间丝蛋白的一种基因，在多种细胞类型中表达，尤其是在间充质细胞中。vimentin基因编码的vimentin蛋白是细胞骨架中间丝的主要成分之一。它在细胞的结构维持、形状稳定、内外信号传导以及细胞迁移过程中发挥作用，vimentin在胚胎发育期间的表达对于胚胎的正常分化和器官形成至关重要。
3、cre-loxp系统的主要原理是在目标基因组的特定位点插入两个loxp序列，形成loxp位点之间的目标区域，通过表达cre酶，该酶将催化loxp序列的切割，并引导dna重组事件的发生，可以实现基因的敲除、插入或倒置。如果同一方向的两个loxp位点位于一条染色体dna链上，cre将识别并敲除loxp位点间的序列。flpo重组酶系统和cre类似，frt位点类似于loxp位点，被用于构建条件性敲除鼠。
4、crispr-cas系统最早在大肠埃希菌中发现。其功能是用来抵御噬菌体的感染，捕获来源于噬菌体的间隔序列整合到自身基因组中，以获得外源抵抗力。crispr-cas系统能使基因组免于噬菌体、病毒等的破坏，其与宿主cas蛋白的获取抗噬菌体能力有关。crispr是多种古菌及细菌处理外来dna侵袭的一种天然免疫系统，利用cas蛋白酶进行切割，达到自身免疫的效果的工具。crispr-cas基因座由一系列编码cas蛋白的基因和一个crispr重复间隔序列组成。典型的crispr重复间隔序列由一段前导序列、一系列短的高度保守的正向重复序列和间隔序列依序排列组成。
5、在胚胎着床领域，目前有较好的孕激素受体驱动pgr-cre用于子宫特异性敲除，该鼠得到广泛应用，已经证明了多种重要分子对子宫的生理调控作用。目前，由wnt7a、sprr2f和ltf驱动的cre鼠也被开发利用，实现子宫上皮特异性敲除。此外，amhr2驱动的cre鼠被用于实现子宫基质内特异性敲除。然而，amhr2-cre效率不高，而且在敲除后无法区分是否影响生殖道的早期发育，还有对胚胎着床的直接作用。使用cre-loxp系统的工具鼠需要携带cre的flox鼠的纯合才能在两条染色体上进行成功的基因敲除，对于多基因敲除鼠的繁育十分艰难。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述问题，首先提供靶向vim基因的sgrna。
2、本发明的第二个目的是提供用于敲入vim基因的dna片段。
3、本发明的第三个目的是提供一种可实现组织特异性敲除的cas9小鼠的构建方法。
4、本发明的第四个目的是提供可实现组织特异性敲除的cas9小鼠的应用。
5、本发明的第五个目的是提供子宫基质条件性敲除鼠tgsgmettl3-pgrflpo/+-vimfsf-cre/+-rosa26lsl-cas9/+的构建方法。
6、本发明的目的通过以下技术方案实现：
7、本发明首先提供靶向vim基因的sgrna，所述sgrna的序列如seq id no：1和seq idno：2所示。
8、本发明还提供用于敲入vim基因的dna片段，所述dna片段5’端到3’端依次包括上游同源臂、frt-6xsv40 pa-frt-kozak-icre-wpre-bgh pa表达框和下游同源臂；所述上游同源臂的核苷酸序列为vimentin基因的第1外显子的起始密码子的5’端紧邻序列，所述下游同源臂的核苷酸序列为vimentin基因组的第1外显子的起始密码子的3’端紧邻序列，所述frt-6xsv40 pa-frt-kozak-icre-wpre-bgh pa表达框的序列如seq id no：3所示。
9、本发明还提供一种可实现组织特异性敲除的cas9小鼠的构建方法，包括以下步骤：
10、s1、构建vimfsf-cre/+小鼠：体外转录获得cas9 mrna和权利要求1所述的sgrna；以bac克隆rp23-14i24为模板，构建含有权利要求2所述dna片段的同源重组载体；将cas9mrna、sgrna和同源重组载体转入小鼠受精卵中，后通过基因型筛选获得；
11、s2、构建pgrflpo/+小鼠：将2a-flop序列插入到pgr基因的3'utr中，后通过基因型筛选获得；
12、s3、构建pgrflpo/+-vimfsf-cre/+小鼠：将vimfsf-cre/+小鼠与pgrflpo/+小鼠杂交，通过基因型筛选获得双阳鼠pgrflpo/+-vimfsf-cre/+小鼠；
13、s4、将pgrflpo/+-vimfsf-cre/+小鼠与rosa26lsl-cas9/+小鼠杂交，通过基因型筛选获得三阳鼠pgrflpo/+-vimfsf-cre/+-rosa26lsl-cas9/+小鼠，即可实现组织特异性敲除的cas9小鼠。
14、本发明上述使用cre与flpo驱动的pgrflpo/+-vimfsf-cre/+-rosa26lsl-cas9/+敲除方案：设计构建vimfsf-cre/+鼠，在vim基因起始密码子部分替换为fsf-cre表达框，vimfsf-cre鼠与pgrflp小鼠交配删除stop表达框，产生双阳鼠pgrflpo/+-vimfsf-cre/+。rosa26lsl-cas小鼠与pgrflpo/+-vimfsf-cre/+小鼠交配后，经基因型鉴定获得cas9表达的三阳小鼠pgrflpo/+-vimfsf-cre/+-rosa26lsl-cas9/+。
15、本研究旨在基于crisprcas9系统创制子宫基质特异性敲除鼠，解决amhr2-cre效率不高的问题。crisprcas9在无需纯合的情况下就可实现组织特异性敲除，解决了传统cre-loxp工具鼠繁育复杂的问题。此外，cas9小鼠与多种sgrna串联小鼠繁育可实现多基因同时敲除，解决了传统cre-loxp工具鼠难以多基因同时敲除的问题。
16、因此，本发明还提供上述方法得到的可实现组织特异性敲除的cas9小鼠在构建组织特异性敲除动物模型中的应用。
17、具体的，本发明还提供子宫基质条件性敲除鼠tgsgmettl3-pgrflpo/+-vimfsf-cre/+-rosa26lsl-cas9/+的构建方法，将三阳鼠pgrflpo/+-vimfsf-cre/+-rosa26lsl-cas9/+小鼠与tgsgmettl3小鼠杂交，经基因型筛选获得子宫基质条件性敲除鼠tgsgmettl3-pgrflpo/+-vimfsf-cre/+-rosa26lsl-cas9/+。
18、优选地，所述tgsgmettl3小鼠的构建方法为：用piggybac转座酶系统将靶向mettl3的sgrna的dna片段整合到小鼠基因组中，后通过基因型鉴定筛选获得。
19、更优选地，所述靶向mettl3的sgrna的dna片段自5’端到3’端依次包括u6启动子、mettl3-sgrna1、u6启动子、mettl3-sgrna2、u6启动子、sggfp编码基因、cag启动子编码基因、mcherry编码蛋白、sv40 poly(a)编码基因、mcherry编码蛋白、p2a肽编码基因、gfp编码基因、bgh poly(a)编码基因。
20、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
21、本发明基于crispr-cas9的基质特异性基因编辑鼠。由vim作为特异性启动子的cre鼠，激活cas9，cas9鼠不仅解决了传统cre鼠的繁育复杂的问题，在无需纯合的情况下就可实现一种组织特异性敲除。cas9鼠可以用于多种sgrna的敲除，为基因编辑模型的开发提供更多的可能性。
22、将得到的cas9鼠与sgmettl3报告鼠交配，成功在子宫基质细胞内向导敲除mettl3基因。本发明为子宫内膜基因研究提供了宝贵的基因编辑模型，克服了双特异性位点介导基因敲除难的挑战。成功构建了crispr-cas9的条件性敲除鼠，为探索其他基因编辑模式动物提供了借鉴，拓宽了兽医领域模式动物的开发。
1.靶向vim基因的sgrna，其特征在于，所述sgrna的序列如seq id no：1和seq id no：2所示。
2.用于敲入vim基因的dna片段，其特征在于，所述dna片段5’端到3’端依次包括上游同源臂、frt-6xsv40 pa-frt-kozak-icre-wpre-bgh pa表达框和下游同源臂；所述上游同源臂的核苷酸序列为vimentin基因的第1外显子的起始密码子的5’端紧邻序列，所述下游同源臂的核苷酸序列为vimentin基因组的第1外显子的起始密码子的3’端紧邻序列，所述frt-6xsv40 pa-frt-kozak-icre-wpre-bgh pa表达框的序列如seq id no：3所示。
3.一种可实现组织特异性敲除的cas9小鼠的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.权利要求3所述方法得到的可实现组织特异性敲除的cas9小鼠在构建组织特异性敲除动物模型中的应用。
5.子宫基质条件性敲除鼠tgsgmettl3-pgrflpo/+-vimfsf-cre/+-rosa26lsl-cas9/+的构建方法，其特征在于，将三阳鼠pgrflpo/+-vimfsf-cre/+-rosa26lsl-cas9/+小鼠与tgsgmettl3小鼠杂交，经基因型筛选获得子宫基质条件性敲除鼠tgsgmettl3-pgrflpo/+-vimfsf-cre/+-rosa26lsl-cas9/+。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述tgsgmettl3小鼠的构建方法为：用piggybac转座酶系统将靶向mettl3的sgrna的dna片段整合到小鼠基因组中，后通过基因型鉴定筛选获得。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述靶向mettl3的sgrna的dna片段自5’端到3’端依次包括u6启动子、mettl3-sgrna1、u6启动子、mettl3-sgrna2、u6启动子、sggfp编码基因、cag启动子编码基因、mcherry编码蛋白、sv40 poly(a)编码基因、mcherry编码蛋白、p2a肽编码基因、gfp编码基因、bgh poly(a)编码基因。
