本发明涉及有机合成，具体涉及一种kyotrophin的合成方法。
背景技术：
1、kyotrophin（l-酪氨酰-l-精氨酸）是一种神经活性二肽，在大脑的疼痛调节中发挥作用。1979年，日本科学家首次从牛的大脑中分离出它。kyotrophin因其发现地日本京都而得名，并因其类似吗啡（或内啡肽）的镇痛活性而得名。kyotrophin有镇痛作用，但不与阿片受体相互作用。相反，它的作用是释放甲胎脑啡肽并稳定其降解。它还可能具有神经介质/神经调节剂的特性。已有研究表明，人体脑脊液中存在颈动脉肽，持续疼痛患者的颈动脉肽浓度较低。
2、kyotrophin是一种具有镇痛特性的内源性神经活性二肽。kyotrophin具有抗炎和抗菌活性。脑脊髓液中的kyotrophin水平与阿尔茨海默病患者神经退行性变的进展呈负相关。
3、kyotrophin的合成方法主要分为生物合成和化学合成，其中生物合成存在以下缺点，酶的专属性不够，生成的三肽杂质（如h-tyr-tyr-arg-oh）较大，同时后处理过程会导致酶的变性失活，酶的回收套用困难，导致成本较高。
4、已报到的kyotrophin化学合成方法如下，以z(ome)-tyr-nhnh2和h-arg(mts)-oh为原料，室温下缩合得到中间体，中间体采用正丁醇和乙醚重结晶进行纯化，再经脱保护，后处理纯化采用离子交换树脂处理，然后采用制备液相色谱进行纯化，最后进行冻干处理得到kyotrophin，总收率48.23%。该方法中z(ome)-tyr-nhnh2的氨基未进行保护，反应过程中，易产生自身反应的二肽杂质h-tyr-tyr-oh。同时中间体纯化和终产品制备液相色谱纯化导致收率较低，冻干的后处理方式，成本高，也不利于工业化大生产。
5、
6、以boc-tyr(bn)-osu和h-arg(mtr)-oh为原料，室温下缩合得到中间体，然后中间体过柱纯化，再经脱保护，后处理同样采用制备液相色谱的方法纯化以及离子交换树脂处理得到kyotrophin，总收率约40.04%。同样的，该方法中间体纯化和终产品制备液相色谱纯化导致收率较低，冻干的后处理方式，成本高，也不利于工业化大生产
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8、以boc-tyr-osu或boc-tyr-onb和h-arg(mtr或pme)-oh为原料，室温下缩合得到中间体，然后中间体采用制备液相色谱进行纯化，再经脱保护,后处理同样采用离子交换树脂进行处理，然后采用制备液相色谱方法，最后采用冻干的方式得到kyotrophin，总收率约34.48%。该方法中boc-tyr-osu或boc-tyr-onb的羟基未进行保护，在该活化酯的合成过程中，会产生自身缩合杂质。同时中间体纯化和终产品制备液相色谱纯化导致收率较低，冻干的后处理方式，成本高，也不利于工业化大生产。
9、
10、上述化学合成方法收率普遍偏低，首先是第一步合成过程中，对中间产物进行了重结晶或柱相析等纯化手段进行分离纯化；其次，终产品均采用了离子交换树脂进行盐型转换，以及制备液相色谱等手段纯化，导致收率偏低，成本高。
技术实现思路
1、本发明采用的起始原料，对相应的活性位点都采用了相对较优的保护策略，因此反应过程中因起始原料生成的副产物少，可直接对中间产物不进行分离纯化，只进行简单的除杂，保证总收率，将缩合剂产生的副产物diu等在第一步中间产物中难去除的杂质，利用副产物与终产品性质的溶解性差异，在终产品的后处理过程进行去除，同时根据kyotrophin的等电点进行除盐，纯化通过ph的调节能有效的去除终产品中的杂质，得到高纯度kyotrophin。该方法操作简单化易于工业化生产，同时降低生产成本。其合成的反应式如下：
2、。
3、其中，本发明提供的kyotrophin的合成方法包括：boc-tyr(tbu)-oh与hosu在缩合剂的作用下得到boc-tyr(tbu)-osu，boc-tyr(tbu)-osu与经过保护的精氨酸进行反应，脱保护得到kyotrophin；其中，缩合剂为dic，反应完成后不进行处理得到boc-tyr(tbu)-osu溶液。
4、经过保护的精氨酸为h-arg(mtr)-oh，反应完成后加酸调节ph值至2-3，萃取，有机相浓缩干得到boc-tyr(tbu)-arg(mtr)-oh；脱保护得到kyotrophin的反应液，减压浓缩除去溶剂及过量的脱保护试剂，加水和萃取剂，水相减压浓缩至体系呈粘稠状，趁热加碱调节ph值至10.5-11.2，加入甲醇，固液分离得到kyotrophin粗品。
5、将kyotrophin粗品溶于水中，升温至50-60℃溶清，加碱调节ph值至11.5-12.0，加入结晶溶剂，待kyotrophin析晶完全后，降温至0-10℃，固液分离得到kyotrophin。其中，结晶溶剂选自甲醇、乙醇或异丙醇等，优选为异丙醇。其中，水的用量为kyotrophin粗品重量的1-3倍，结晶溶剂的用量为kyotrophin粗品重量的3-5倍。
6、具体地，本发明提供的kyotrophin的合成方法包括：
7、(1) boc-tyr(tbu)-osu的合成
8、于非质子溶剂中，boc-tyr(tbu)-oh与hosu在dic的作用下，于室温下反应得到boc-tyr(tbu)-osu。其中，boc-tyr(tbu)-oh、hosu和dic的摩尔比为1：1.0-1.1：1.0-1.1。
9、(2) boc-tyr(tbu)-arg(mtr)-oh的合成
10、于溶剂a中，在缚酸剂的作用下，boc-tyr(tbu)-osu和h-arg(mtr)-oh于室温下缩合得到boc-tyr(tbu)-arg(mtr)-oh。其中，boc-tyr(tbu)-osu、h-arg(mtr)-oh和缚酸剂的摩尔比为1：1.0-1.2：1.0-1.5。
11、(3) kyotrophin的合成
12、于溶剂b中，在室温下，boc-tyr(tbu)-arg(mtr)-oh在脱保护试剂作用下反应，经后处理和纯化得到kyotrophin。其中，boc-tyr(tbu)-arg(mtr)-oh和脱保护试剂的摩尔比为1：3-20。
13、其中，在步骤(1)中，非质子溶剂选自二氯甲烷、四氢呋喃、丙酮、1.4-二氧六环或乙腈等，优选为四氢呋喃。
14、其中，在步骤(2)中，溶剂a选自二氯甲烷、四氢呋喃、丙酮、1.4-二氧六环、乙腈、四氢呋喃和水的混合溶剂、丙酮和水的混合溶剂、1.4-二氧六环和水的混合溶剂或乙腈和水的混合溶剂等，优选为四氢呋喃和水的混合溶剂。缚酸剂选自三乙胺、diea、碳酸钠、碳酸钾或碳酸氢钠等，优选为碳酸氢钠。
15、其中，在步骤(3)中，溶剂b选自水、二氯甲烷、乙酸乙酯或四氢呋喃等，优选为二氯甲烷。脱保护试剂选自三氟乙酸、氯化氢、氯化氢的二氯甲烷溶液、氯化氢的四氢呋喃溶液、氯化氢的乙酸乙酯溶液或盐酸等，优选为三氟乙酸。
16、其中，脱保护反应完成后，减压浓缩除去溶剂及过量的脱保护试剂，加水（具体为kyotrophin粗品重量重量的1.5-4.0倍）和乙酸乙酯（具体为kyotrophin粗品重量重量的1.5-4.0倍），水相减压浓缩至体系呈粘稠状，趁热加氨水调节ph值至10.5-11.2，加入甲醇，固液分离得到kyotrophin粗品。其中，甲醇的用量为kyotrophin粗品重量的6-9倍。
17、其中，碱选自氢氧化钠水溶液、氢氧化锂水溶液、氢氧化钾水溶液或氨水等，优选为氨水。
18、优选地，将kyotrophin粗品溶于水中，升温至50-60℃溶清，加氨水调节ph值至11.5-12.0，接着滴加异丙醇，待kyotrophin析晶完全后，降温至0-10℃后过滤得kyotrophin。其中，水的用量为kyotrophin粗品重量的1-3倍，异丙醇的用量为kyotrophin粗品重量的3-5倍。
19、优选地，本发明提供的kyotrophin的合成方法包括：
20、(1) boc-tyr(tbu)-osu的合成
21、于非质子溶剂中，boc-tyr(tbu)-oh与hosu在dic的作用下，于室温下反应得到boc-tyr(tbu)-osu溶液。其中，boc-tyr(tbu)-oh、hosu和dic的摩尔比为1：1.0-1.1：1.0-1.1；非质子溶剂选自二氯甲烷、四氢呋喃、丙酮、1.4-二氧六环或乙腈等。
22、(2) boc-tyr(tbu)-arg(mtr)-oh的合成
23、于溶剂a中，在缚酸剂的作用下，boc-tyr(tbu)-osu和h-arg(mtr)-oh在室温下进行缩合反应，反应完成后，加酸调节ph值至2-3，萃取，有机相水洗，有机相浓缩干得到boc-tyr(tbu)-arg(mtr)-oh。其中，boc-tyr(tbu)-osu、h-arg(mtr)-oh和缚酸剂的摩尔比为1：1.0-1.2：1.0-1.5；溶剂a选自二氯甲烷、四氢呋喃、丙酮、1.4-二氧六环、乙腈、四氢呋喃和水的混合溶剂、丙酮和水的混合溶剂、1.4-二氧六环和水的混合溶剂或乙腈和水的混合溶剂等；缚酸剂选自三乙胺、diea、碳酸钠、碳酸钾或碳酸氢钠等。
24、(3) kyotrophin的合成
25、于溶剂b中，在室温下，boc-tyr(tbu)-arg(mtr)-oh在脱保护试剂作用下反应，反应完成后，减压浓缩除去溶剂及过量的脱保护试剂，再加水和萃取剂，水相减压浓缩至体系呈粘稠状，趁热加碱调节ph值至10.5-11.2，加入甲醇，固液分离得到kyotrophin粗品。其中，boc-tyr(tbu)-arg(mtr)-oh和脱保护试剂的摩尔比为1：3-20，甲醇的用量为kyotrophin粗品重量的6-9倍；溶剂b选自水、二氯甲烷、乙酸乙酯或四氢呋喃等，脱保护试剂选自三氟乙酸、氯化氢、氯化氢的二氯甲烷溶液、氯化氢的四氢呋喃溶液、氯化氢的乙酸乙酯溶液或盐酸等。
26、(4) kyotrophin的纯化
27、将kyotrophin粗品溶于水中，升温至50-60℃溶清，加碱调节ph值至11.5-12.0，接着滴加结晶溶剂，待kyotrophin析晶完全后，降温至0-10℃，固液分离得到kyotrophin。其中，结晶溶剂选自甲醇、乙醇或异丙醇等，水的用量为kyotrophin粗品重量的1-3倍，结晶溶剂的用量为kyotrophin粗品重量的3-5倍；碱选自氢氧化钠水溶液、氢氧化锂水溶液、氢氧化钾水溶液或氨水等。
28、更优选地，本发明提供的kyotrophin的合成方法包括：
29、(1) boc-tyr(tbu)-osu的合成
30、于四氢呋喃中，boc-tyr(tbu)-oh与hosu在dic的作用下，于室温下反应得到boc-tyr(tbu)-osu的四氢呋喃溶液。其中，boc-tyr(tbu)-oh、hosu和dic的摩尔比为1：1.0-1.1：1.0-1.1。
31、(2) boc-tyr(tbu)-arg(mtr)-oh的合成
32、在水中加入h-arg(mtr)-oh，滴加碳酸氢钠溶液，再滴加boc-tyr(tbu)-osu的四氢呋喃溶液，室温下反应，反应完成后，加盐酸调节ph值至2-3，乙酸乙酯萃取，有机相水洗，有机相浓缩干得到boc-tyr(tbu)-arg(mtr)-oh。其中，boc-tyr(tbu)-osu、h-arg(mtr)-oh和碳酸氢钠的摩尔比为1：1.0-1.2：1.0-1.5。
33、(3) kyotrophin的合成
34、将boc-tyr(tbu)-arg(mtr)-oh加入二氯甲烷中，在室温下，滴加三氟乙酸，反应完成后，减压浓缩除去二氯甲烷及过量的三氟乙酸，加水和乙酸乙酯，得到水相，水相减压浓缩至体系呈粘稠状，趁热加氨水调节ph值至10.5-11.2，加入甲醇，过滤得到kyotrophin粗品。其中，boc-tyr(tbu)-arg(mtr)-oh和三氟乙酸的摩尔比为1：3-20，甲醇的用量为kyotrophin粗品重量的6-9倍。
35、(4) kyotrophin的纯化
36、将kyotrophin粗品溶于水中，升温至50-60℃溶清，加氨水调节ph值至11.5-12.0，接着滴加异丙醇，待kyotrophin析晶完全后，降温至0-10℃后过滤得kyotrophin。其中，水的用量为kyotrophin粗品重量的1-3倍，异丙醇的用量为kyotrophin粗品重量的3-5倍。
37、本专利具有如下优势：
38、(1)纯化过程简单，步骤1无需进行处理，步骤2仅需萃取处理，步骤3为萃取和ph（kyotrophin的等电点在10.8左右），步骤4为较高温度下重结晶（在特定ph值）；相对于现有技术的过柱处理，简单很多，适合工业化生产；
39、(2)本专利得到的kyotrophin的纯度高（99%以上），收率高（70%上，优选条件下75%以上）；
40、(3)在纯化的过程中，先加入碱，再滴加溶剂，避免产品提前析出，出现杂质包裹在产品中，无法去除；
41、(4)本专利通过hosu活化boc-tyr(tbu)-oh，并采用了特定保护基的精氨酸（具体为h-arg(mtr)-oh），通过活化酯法进行酸胺缩合，无需对精氨酸的羧基进一步保护，不但提升收率，成本低，还简化了后续处理过程；通过脱保护试剂同时脱除3个保护基，简化了流程。
1.kyotrophin的合成方法，所述方法包括：boc-tyr(tbu)-oh与hosu在缩合剂的作用下得到boc-tyr(tbu)-osu，boc-tyr(tbu)-osu与经过保护的精氨酸进行反应，脱保护得到kyotrophin；其特征在于，
2.根据权利要求1所述kyotrophin的合成方法，其特征在于，所述方法包括：
3.根据权利要求2所述的kyotrophin的合成方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述非质子溶剂选自二氯甲烷、四氢呋喃、丙酮、1.4-二氧六环或乙腈。
4.根据权利要求2所述的kyotrophin的合成方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述溶剂a选自二氯甲烷、四氢呋喃、丙酮、1.4-二氧六环、乙腈、四氢呋喃和水的混合溶剂、丙酮和水的混合溶剂、1.4-二氧六环和水的混合溶剂或乙腈和水的混合溶剂；所述缚酸剂选自三乙胺、diea、碳酸钠、碳酸钾或碳酸氢钠。
5.根据权利要求2所述的kyotrophin的合成方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述溶剂b选自水、二氯甲烷、乙酸乙酯或四氢呋喃，所述脱保护试剂选自三氟乙酸、氯化氢、氯化氢的二氯甲烷溶液、氯化氢的四氢呋喃溶液、氯化氢的乙酸乙酯溶液或盐酸。
6.根据权利要求1所述的kyotrophin的合成方法，其特征在于，脱保护反应完成后，减压浓缩除去溶剂及过量的脱保护试剂，加水和乙酸乙酯，水相减压浓缩至体系呈粘稠状，趁热加氨水调节ph值至10.5-11.2，加入甲醇，固液分离得到kyotrophin粗品；所述甲醇的用量为kyotrophin粗品重量的6-9倍。
7.根据权利要求1所述的kyotrophin的合成方法，其特征在于，所述碱选自氢氧化钠水溶液、氢氧化锂水溶液、氢氧化钾水溶液或氨水。
8.根据权利要求1所述的kyotrophin的合成方法，其特征在于，将kyotrophin粗品溶于水中，升温至50-60℃溶清，加氨水调节ph值至11.5-12.0，接着滴加异丙醇，待kyotrophin析晶完全后，降温至0-10℃后过滤得kyotrophin；所述水的用量为kyotrophin粗品重量的1-3倍，所述异丙醇的用量为kyotrophin粗品重量的3-5倍。
9.根据权利要求1所述的kyotrophin的合成方法，其特征在于，所述方法包括：
10.根据权利要求1所述的kyotrophin的合成方法，其特征在于，所述方法包括：
