发明领域本发明涉及医学、免疫学和疫苗领域。本发明提供了能够刺激免疫系统的疫苗药盒和组合物，例如针对致病性呼吸道细菌和致病性呼吸道病毒。本发明还提供了施用所述疫苗的方法，使个体获得对致病菌和病毒的免疫力。特别地，本发明涉及针对呼吸道病毒或细菌例如sars、mers和covid-19的疫苗组合物。
背景技术：
1、冠状病毒是一组在哺乳动物中引起疾病的rna病毒。它们引起从轻度到致命范围的呼吸道感染。人类的轻微疾病包括普通感冒，而更致命的形式可以引起sars、mers和covid-19。冠状病毒构成利比维里亚界(ribiviria)尼多维拉目(nidovirales)冠状病毒科(coronaviridae)中的正冠状病毒(orthocoronavirinae)亚科。它们是包膜病毒，具有正义单链rna基因组和螺旋对称的核衣壳。
2、严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov2)是引起2019冠状病毒病(covid 19)的冠状病毒株，它是导致covid-19大流行的呼吸道疾病。它也被称为2019新型冠状病毒(2019-ncov)或人冠状病毒2019(hcov-19或hcov-19)。sars-cov2是一种巴尔的摩iv级正义单链rna病毒，在人类是传染性的。它是导致2002-2004年sars爆发的sars-cov-1毒株的继任者。
3、sars-cov2是严重急性呼吸综合征相关的冠状病毒(sarsr-cov)的一种毒株。认为它具有人畜互传的起源，与蝙蝠冠状病毒有着密切的遗传相似性，暗示它出现自蝙蝠传播的病毒。
4、许多患有冠状病毒或其他病毒或细菌性疾病的人经历与疾病相关的影响，如疲劳、精力不足、肌肉疼痛、关节疼痛、关节和骨酸痛等。当主要疾病被控制后，这些影响不一定消失。因此，约10-20％的covid-19感染者在几个月后经历远期效应(late effect)。
5、wo 2021/178306涉及一种用于预防sars-covid-2感染的免疫原性组合物。然而，所述免疫原性组合物不同于本发明的组合物，并且所述免疫原性组合物是肌内施用的。
6、最近并在本文的实施例中报道的是，本发明人观察到，当疫苗组合物经鼻或经肺施用时，患有由covid-19引起的呼吸道疾病的受试者具有显著更好的免疫反应。考虑了在病毒或细菌与其宿主相遇的粘膜部位施用疫苗组合物的原则将适用于所有针对由呼吸道病毒或细菌引起的呼吸道疾病的疫苗。
7、因此，需要有效和安全的新疫苗来预防来源于呼吸道细菌和病毒感染引起的疾病。存在对新的佐剂和优化的施用以在接种疫苗后实现更好的免疫反应的需求。这类新疫苗需要有吸引力的特性组合，所述特性包括配制成产品时的强大免疫反应和低毒性。特别地，在病毒感染领域，需要这类新疫苗，其中仅在过去二十年里，几次mers和sars的爆发在几个国家蔓延。这类流行病也可能对招致病毒的那些个人产生严重影响，例如普遍地对旅行、医院、商业和社会有严重影响。
8、在大流行的covid-19情形期间，很明显需要有效的疫苗和疗法来对抗疾病或减轻疾病的副作用，所述疾病包括病毒性疾病，如冠状病毒疾病，例如covid-19。
9、因此，需要有效和安全的新疫苗来预防呼吸道系统中起源自细菌感染和特别是病毒感染的疾病。
技术实现思路
1、在一个方面，本发明涉及一种疫苗组合物，其包含在呼吸道病毒或细菌表面表达的蛋白质，用于鼻施用或吸入施用。该组合物为固体形式，以粉末或颗粒组合物的形式施用。该组合物中的蛋白质起抗原的作用，并且在该组合物中，蛋白质以正确折叠的三维结构存在，从而在施用后被正确识别。在实施方案中，呼吸道病毒是冠状病毒，且抗原是sars-cov-2刺突蛋白。该疫苗组合物包含一种或多种可药用赋形剂。当该组合物为颗粒形式时，颗粒具有1至50μm范围的平均粒度。粒度取决于施用途径。较小的粒度适合施用至肺。该疫苗组合物还可以含有佐剂，例如toll样受体，如tlr3，以及一种或多种免疫刺激剂。
2、尽管本文的实施例涉及用于预防covid-19感染的疫苗组合物，但考虑了所述组合物可以与其他抗原配制，所述抗原例如那些抗covid-19的抗原，尤其是抗由细菌或病毒引起的呼吸道疾病的抗原。如本文所述，没有观察到与脑部炎症有关的副作用，且鼻施用途径似乎有利于避免此类副作用。
3、更具体地，本发明涉及疫苗组合物，其包含在呼吸道冠状病毒表面上表达的一种或多种蛋白质和一种或多种可药用赋形剂，其中所述组合物为具有2至50μm范围的平均粒度的颗粒形式，并且其中所述一种或多种蛋白质包含冠状病毒sars、mers或covid-19的刺突蛋白或其变体，并且其中所述组合物包含一种或多种糖和tlr激动剂。在实施方案中，tlr激动剂是tlr3激动剂。
4、在另一方面，本发明涉及一种组合物，用于通过向受试者鼻内或肺施用所述组合物来预防呼吸道细菌或病毒(例如冠状病毒)感染。大多数当前的疫苗策略针对的是提供全灭活或减毒的病毒或细菌的组合物，其核心目的是引发中和抗体的产生。也可以使用衍生自病毒或细菌的抗原。
5、通常，所述组合物包含相关抗原或灭活或减毒的细菌或病毒，例如肺炎链球菌(streptococcus pneumonia)、流感嗜血杆菌(haemophilus influenza)、卡他莫拉菌(moraxella catarrhlis)等，或例如冠状病毒sars、mers或covid-19的刺突蛋白或其变体，并且其中所述组合物包含一种或多种糖和tlr激动剂。合适的组合物是上述疫苗组合物，并在所附权利要求书中要求保护。
6、在另一方面，本发明提供了抗原，其基于covid-19的刺突蛋白。这些蛋白质包括seq id no:3和seq id no:7或与seq id no:3或seq id no:7具有99％序列同一性的蛋白质。此类抗原在疫苗接种和疫苗组合物中的用途也是本发明的方面。
7、两个氨基酸序列之间或两个核酸序列之间的同源性由参数“同一性”描述。序列比对和同源性得分的计算可以使用例如用于蛋白质和dna比对的完整smith-waterman比对来完成。默认的评分矩阵blosum50和同一性矩阵(identity matrix)分别用于蛋白质和dna比对。对于蛋白质，缺口中第一个残基的罚分是-12，对于dna，缺口中第一个残基的罚分是-16，而对于蛋白质，缺口中额外残基的罚分是-2，对于dna，缺口中额外残基的罚分是-4。可以用fasta软件包版本v20u6进行比对。可以使用“clustalw”进行蛋白质序列的多重比对。可以使用蛋白质比对作为模板进行dna序列的多重比对，用dna序列中的相应密码子替换氨基酸。备选地，可以使用不同的软件来比对氨基酸序列和dna序列。例如，通过使用emboss软件包(http://emboss.org)版本2.8.0中的needle程序来确定两个氨基酸序列的比对。使用的替换矩阵为blosum62，缺口打开罚分为10，缺口延伸罚分为0.5。
8、认为肺和鼻内施用促进免疫球蛋白向iga的转换，iga是一种专门用于包括肺和肠道在内的粘膜表面的免疫球蛋白。认为tlr激动剂促进巨噬细胞的活化，导致增加的抗原呈递能力，增加的包括cd86在内的共刺激分子的表达，以及增加的细胞因子和趋化因子(包括干扰素)的产生和释放。因此，tlr2激动剂促进t细胞活化，这是成功诱导生产性中和b细胞反应的基础。
9、本发明还涉及一种颗粒形式的载体组合物(carrier composition)，用作衍生自呼吸道病毒或呼吸道细菌的抗原材料的载体，其中所述载体组合物包含一种或多种可药用赋形剂和佐剂，其中一种或多种可药用赋形剂包含i)选自海藻糖、蔗糖和乳糖的二糖，ii)选自环糊精的多糖，并且其中所述佐剂是tlr激动剂。
10、疫苗组合物(即，包含载体组合物和抗原材料的组合物)适合通过鼻或肺施用来使用。
11、在优选的方面，所述抗原材料衍生自病毒。
12、在这类载体组合物中，优选所述二糖是海藻糖，所述多糖是羟丙基-β-环糊精，且tlr激动剂是tlr3激动剂。
13、海藻糖是一种稳定剂和填料(filler)，且羟丙基β-环糊精是填料或填充材料(bulk material)。
14、在载体组合物中，二糖的浓度在10％-60％w/w，例如30％-55％w/w或40％-50％w/w的范围内，和/或多糖的浓度在10％-60％w/w，例如30％-55％w/w或40％-50％w/w的范围内，和/或佐剂的浓度为0.1％-5％w/w。
15、本发明的一个方面涉及一种疫苗组合物，用于预防呼吸道病毒或细菌感染，所述组合物包含i)如权利要求1-6中任一项所述的载体组合物，和ii)衍生自呼吸道病毒或细菌的抗原材料。
16、在本上下文中，术语“衍生自呼吸道病毒或细菌的抗原材料”应理解为例如灭活或减毒的呼吸道病毒或细菌、分离自呼吸道病毒或细菌的蛋白质或其片段、来自呼吸道病毒或细菌的重组蛋白质或片段，或在病毒表面表达的蛋白质或其片段。
17、本发明还提供了疫苗试剂盒，其包含本发明的疫苗组合物以及包含维生素a和/或维生素d的组合物。
18、应当注意，当本文描述与本发明的诸方面中的一个方面相关的细节时，这些细节也是本发明其他方面的一部分。例如，当描述与本发明的疫苗组合物有关的细节时，这些细节也与根据本发明使用的组合物等有关。
19、发明详述
20、可以将本发明的目标问题制定为提供一种基于药物组合物的疫苗，该疫苗可以鼻内施用或通过吸入来肺施用，以预防呼吸道细菌和呼吸道病毒的感染。此类病毒的非限制性实例如本文所述的病毒，包括sars、mers或covid，特别是covid感染。如本文所示，本发明的疫苗组合物仅通过鼻内施用即可提供保护。因此，本发明人发现，本发明疫苗组合物的鼻内和气管内施用(模拟肺施用)提供了i)合适的免疫(见图29)，ii)通过形成中和抗体进行肺保护(图30)，iii)抑制病毒使病毒不能与其受体结合(图31)，和iv)避免炎症，如脑炎症(图32)。
21、令人惊讶的是，本发明的疫苗组合物在不进行首次肌内施用的情况下提供了抗感染的保护作用。因此，本发明的组合物可以在不需要医疗专业人员用注射器注射它到有需要的受试者体内的情况下施用。同样令人惊讶的是，使用本发明的疫苗组合物经鼻施用似乎完全避免了已知疫苗组合物施用(如covid)后观察到的常见副作用，即，脑炎症。
22、在第一方面，本发明提供了一种疫苗组合物。该疫苗组合物的物理外观为干粉形式，特别是颗粒形式，并且该疫苗组合物包含抗原、佐剂和至少一种可药用赋形剂。所述抗原是在呼吸道病毒或细菌表面表达的蛋白质。所述疫苗组合物用于气管内、肺或鼻内施用。所述疫苗组合物的施用可以与维生素a和/或维生素d的施用结合，可以在所述疫苗组合物施用之前、同时或之后施用维生素a和/或维生素d。如下所述，抗原以正确的构象和三维结构存在于本发明的疫苗组合物中，这确保了被b淋巴细胞的正确识别。
23、所述抗原是在引起呼吸道疾病的病毒或细菌表面表达的一种或多种蛋白质。该蛋白质可以是全长蛋白质或其片段。特别地，所述抗原是全长蛋白，例如covid-19的刺突蛋白或其变体，特别是全长蛋白(seq id no:1)、由sars-cov-2刺突s1表达的蛋白质(seq idno:2)、isr52(seq id no:3)、isr52-ds(seq id no:7)和其他已知和未知变体，包括本文实施例中提到的那些。该组合物和/或施用方法提供了天然构象的抗原，这允许以正确的三维结构呈递蛋白质，以完整的结合特性对接其天然受体，即，呼吸道表达的ace2受体。完整的构象结构对于幼稚igm b淋巴细胞的初始识别是关键的，其在内化后，cd4+t辅助细胞的加工和激活被诱导，以进行体细胞高突变和转换为igg类和iga类，与该蛋白质的重要相互作用部分如受体结合结构域(rbd)结合。本发明提供了一种疫苗组合物，其中蛋白质保持其正确的三维结构。
24、呼吸道病毒可以是流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、偏肺病毒(metapneumovirus)、鼻病毒(rhinovirus)、冠状病毒(例如，sars、mers、covid-19、α-、β-、δ-、γ-冠状病毒，以及导致上呼吸道疾病的冠状病毒(29e,oc43,nl63和hku1)、腺病毒、博卡病毒(bocavirus)。
25、呼吸道细菌可能是肺炎链球菌、肺炎支原体(mycoplasma pneumonia)、流感嗜血杆菌、肺炎嗜衣原体(chlamydophilia pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(chlamydiapsittaci)、卡他莫拉菌、结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)、鸟分枝杆菌(mycobacterium avis)、海洋分枝杆菌(mycobacterium marinum)。
26、当所述抗原是选自seq id no:3或seq id no:7的covid-19刺突蛋白或与seq idno:3或seq id no:7具有99％或更多序列同一性的covid-19刺突蛋白时，特别地开发了本发明的组合物。
27、从本文的实施例看出，本发明的一个方面涉及sars-cov-2刺突s1蛋白候选疫苗isr52的开发和测试。认为sars-cov-2刺突糖蛋白是针对严重covid-19疾病的保护性免疫的必需抗原。几种基于刺突蛋白的亚单位疫苗在临床和临床前开发中显示出功效。对通过皮下、鼻内和气管内途径施用isr52的效果进行了比较，气管内途径是对肺吸入的模拟，据我们所知，之前尚未对sars-cov-2疫苗进行过该测试。
28、即使在低剂量isr52时，两种呼吸道途径在致命攻击的小鼠模型中也能提供100％的保护，而低剂量皮下免疫只观察到部分保护。结果显示，抗刺突igg和iga与关注的变体交叉反应，诱导持久的细胞免疫，并表明了将刺突s1蛋白与佐剂聚ic:lc组合时平台的稳健性。
29、然而，考虑了所述疫苗组合物中的成分，即，tlr受体和可药用赋形剂，形成其他抗原的合适基础制剂，因此，该制剂通常可以用于开发鼻施用疫苗，以预防呼吸道细菌和病毒引起的感染。
30、佐剂可以是模式识别受体(prr)激动剂，如toll样受体(tlr)激动剂或rig受体激动剂。
31、iga是通过ig的类别转换产生的，所述ig的类别转换受多个过程调节。cd40-cd40l的结合和其他细胞因子il-4、il-5、il-6、il-10和il-21的分泌促进th2细胞的成熟，这促进向不同ig亚型的类别转换。视黄酸是维生素a的代谢产物，其也与il-5和il-6协同作用，以诱导iga分泌。
32、认为肺或鼻内施用促进免疫球蛋白向iga的转换，iga是专门用于包括肺和肠道(gut)在内的粘膜表面的免疫球蛋白。认为tlr激动剂促进巨噬细胞的活化，导致增加的抗原呈递能力，增加包括cd86在内的共刺激分子的表达，以及增加包括干扰素在内的细胞因子和趋化因子的产生和释放。因此，tlr激动剂促进t细胞活化，这是成功诱导生产性中和b细胞反应的基础。tlr3也激活rig-1，其刺激干扰素α的产生。如果干扰素α产生晚或在covid-19疾病中不存在，则观察到死亡或严重的疾病。
33、大规模疫苗接种运动改变了covid-19大流行的进程，并降低了与sars-cov-2感染相关的发病率和死亡率。然而，下降的免疫力和抗原漂移可能导致需要更新的和改进的在各国之间平等分配的疫苗。一些二代疫苗试图针对感染部位，即呼吸道，以诱导局部免疫。这些包括重新配制为鼻喷雾剂的许可疫苗，以及设计用于鼻内施用或雾化的新候选疫苗(由who covid-19疫苗追踪和景观(who.int)汇编的临床试验信息)。对这些候选者的临床前结果表明，它们对sars-cov-2的保护作用相当或更好，其中一个甚至描述了诱导消除性免疫(sterilizing immunity)。
34、尽管基于针的疫苗接种是疫苗施用的金标准，但它存在几个局限性。首先，可注射的疫苗配制成需要冷藏的不稳定液体，或配制成冻干粉用于复溶。其次，它需要训练有素的卫生保健人员，这在非工业化国家和偏远地区可能是一个问题。第三，存在针头刺伤和针头重复使用的风险，增加了交叉污染的可能性。第四，由于相关的针头恐惧症和注射部位的疼痛，对基于针的疫苗接种的依从性可能低，最后，通过注射实施的疫苗接种主要诱导全身免疫反应，这些反应并不专门针对病原体的感染区域，如粘膜部位。因此，非常需要备选的施用方式。
35、已经探索了各种无针施用途径。特别是，呼吸道施用似乎是一种令人感兴趣的施用方式，尤其是针对引起呼吸道感染的空气传播微生物的疫苗。由于呼吸道粘膜大的表面积、可渗透的上皮和高灌注的性质，呼吸道粘膜是生物药物摄取的最佳靶之一。此外，由于呼吸道持续暴露于异物，气道中含有抗原呈递细胞(apc)，如肺泡巨噬细胞和树突状细胞，它们充当了抵抗进入体内的抗原的防御系统。
36、因此，与例如皮下或肌内施用的疫苗组合物相比，考虑了直接靶向和递送针对呼吸道感染引起的疾病的疫苗组合物(例如本文所述的covid-19疫苗组合物)至呼吸道是有利的。
37、用于鼻或肺疫苗接种的组合物是已知的。然而，大多数此类组合物为液体形式，旨在通过喷雾或气溶胶递送。本发明的组合物为干粉形式，含有抗原颗粒与一种或多种可药用赋形剂的混合物。
38、粉末或颗粒材料以含有疫苗组合物的合适装置的形式提供给受试者。当组合物用于鼻或肺施用时，由受试者/她(他)自己施用该组合物是可能的。与用于鼻或肺施用的已知组合物相反，本发明的疫苗组合物被设计为由受试者在鼻腔中嗅闻。取决于本发明疫苗组合物的特性，该组合物也可以应用于肺或气管。
39、通常通过合适的装置进行鼻施用。合适的装置包括单位剂量分配器，如瑞典隆德iconovo ab提供的来自葡萄牙hovione的powdair(口吸入，但也可以适用鼻施用。aptar unidose是一种用于儿科使用的鼻用干粉吸入装置。此类装置的合适材料包括聚丙烯等。
40、通常通过吸入器进行经口施用来实施气管或肺施用。
41、如上所述，疫苗组合物的制剂设计为维持抗原的三维结构的方式。因此，必须仔细选择组合物中使用的各种赋形剂，以避免破坏抗原的三维结构。
42、通过这种方式，可以i)提供具有优异储存稳定性的干疫苗组合物，ii)避免使用可能在应用部位产生不良反应或可能破坏蛋白质三维结构的液体，和iii)确保组合物在施用部位停留足够的时间。
43、除了对免疫力的潜在益处之外，与注射制剂相比，吸入或经鼻施用的疫苗制剂具有后勤优势。当疫苗可以作为干粉储存和施用(吸入或经鼻施用)时尤其如此，完全避免了冷链分配的需要。这类疫苗可以通过一次性干粉吸入器直接施用至下呼吸道，因此无需针头。使用干粉疫苗的临床前研究显示了对包括结核分枝杆菌、人乳头瘤病毒、a型肉毒神经毒素和甲型流感病毒在内的多种病原体和毒素都有前景，并且安全有效的sars-cov-2干粉疫苗将是全球疫苗接种工作的福音。
44、本发明提供了一种疫苗组合物，其包含sars-cov-2刺突蛋白和一种或多种可药用赋形剂，其中所述组合物为颗粒形式，具有平均粒度在1至50μm的范围。平均粒度取决于施用后粉末应在的位置。在施用至鼻粘膜的情况下，平均粒度应在20至50μm的范围，如30至40μm，并且粒度分布显示，小于10％的颗粒粒度为10μm或更小。如果疫苗组合物用于施用至肺，平均粒度应为10μm或更小，如最多8μm、最多6μm、最多5μm，或在1μm至5μm的范围，如在3μm至5μm的范围。
45、粒度通常可以通过使用干燥形式的微粉化材料或通过微粉化最终组合物来实现。
46、由于疫苗组合物以干粉形式存在，因此必须将粉末装填入合适的装置中。这种装置必须由疫苗组合物不粘附的材料制成，因为疫苗组合物粘附会导致施用剂量的变化。此外，疫苗组合物必须是可流动的，以有效地用粉末填充装置并确保正确的施用剂量。因此，要求本发明的疫苗组合物在根据欧洲药典10.0中2.9.16所述的方法使用直径为10±0.01mm的无杆漏斗和喷嘴1进行测量时具有合适的流动性。
47、从本文的实施例中可以看出，在总共5g的疫苗组合物中仅含有15mg抗原。因此，选择一种或多种可药用赋形剂是重要的，以i)确保存在蛋白质的正确构象，ii)为最终的疫苗组合物提供足够的流动性，iii)提供对鼻或肺粘膜无刺激性的物质，iv)提供可生物降解的物质-至少对于肺施用是可生物降解的物质，以及v)提供不会粘附至装置的物质(以排除不正确的使用剂量)。
48、合适的可药用赋形剂选自纤维素、纤维素衍生物、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素、微晶纤维素、包括单糖、二糖、低聚糖、多糖的糖、包括肽的氨基酸、及它们的混合物。
49、一般来说，本发明的疫苗组合物含有赋形剂，所述赋形剂确保i)颗粒/粉末的合适流动性，ii)颗粒内的内聚性(intra-particle cohesivity)的降低，iii)蛋白质的稳定以维持正确的构象，iv)蛋白质的稳定性以避免聚集，以及v)组合物的合适体积以能够处理和加工该组合物。
50、氨基酸可以作为表面改性剂存在，以改善颗粒流动并降低颗粒内的内聚性。可替代使用的其他合适的赋形剂包括任何磷脂或表面活性剂，优选地亮氨酸(包括二亮氨酸或三亮氨酸)和/或卵磷脂、nacl、mgcl2。备选地，硬脂酸镁或硬脂酰富马酸钠将实现相同的效果，但需要随后的机械添加，而不是直接通过喷雾干燥。
51、存在糖或替代剂来稳定蛋白质，通过固定并维持蛋白质的物理构象在无定形晶格中来防止聚集和降解。这可以通过多种糖或糖醇来实现。优选使用二糖，且优选海藻糖。优选具有高过渡玻璃化温度的糖，因为这限制了在较高环境湿度下的流动性。可以考虑葡萄糖、蔗糖、乳糖、右旋糖(dextrose)、甘露醇、麦芽糖醇。也可以考虑氨基酸和氨基酸衍生物。
52、此外，由于填充剂(bulking agent)在喷雾干燥原料溶液中的高粘度，将它们用作工艺增强剂。此类赋形剂包括：糖、糖醇、环糊精、氨基酸、聚合物或其盐。具体实例是环糊精、羟丙甲基纤维素(hpmc)、hpmc衍生物、羟丙基纤维素、乳糖、甘露醇、聚乙二醇、聚乳酸(pla)、聚乳酸-甘醇酸(plga)和聚山梨酸酯。
53、具体地，所述一种或多种可药用赋形剂选自二糖、低聚糖、氨基酸、肽和多肽。
54、单糖选自甘露糖、半乳糖、岩藻糖、葡萄糖、乳果糖。
55、二糖选自海藻糖、蔗糖、乳糖。如实施例所示，海藻糖是一种合适的赋形剂。
56、另一种合适的赋形剂是环糊精，例如羟丙基β-环糊精。
57、进一步合适的可药用赋形剂可以是选自亮氨酸或赖氨酸的氨基酸和/或可以选自二亮氨酸或三亮氨酸。特别是，就疫苗组合物的大规模生产而言，hpmc似乎是一种合适的可药用赋形剂。
58、本发明的一个目的是提供一种疫苗组合物，其具有尽可能少的可药用赋形剂，但仍以维持抗原的正确三维结构为目的。因此，在令人感兴趣的实施方案中，除了抗原(和抗原组合物中所含的成分)之外和除了佐剂(和佐剂组合物中所含的成分)之外，疫苗组合物还含有i)碳水化合物(单糖、二糖、低聚糖或多糖)，ii)氨基酸，或iii)肽。特别是，这种疫苗组合物含有i)海藻糖，ii)羟丙基-β-环糊精，iv)亮氨酸，v)三亮氨酸，vi)海藻糖和羟丙基-β-环糊精的组合，vii)海藻糖和亮氨酸的组合，vii)海藻糖和三亮氨酸的组合，或viii)海藻糖、羟丙基-β-环糊精和亮氨酸的结合，或ix)海藻糖和三亮氨酸的组合，或x)海藻糖、羟丙基-β-环糊精和三亮氨酸的组合。在任一i)至x)中可以包括hpmc。
59、一般而言，本发明的疫苗组合物包含：
60、i)抗原，以及
61、ii)佐剂，和/或
62、iii)流动改善剂，和/或
63、iv)用于抗原构象的稳定剂，和/或
64、v)填充剂。
65、一种可药用赋形剂可以具有一种或多种上述性质iii)-v)。
66、抗原通常以10％至30％w/w例如10％至20％w/w的范围，例如约15％w/w的浓度存在于组合物中。
67、佐剂通常以0.1％至5％w/w，例如0.1至2％w/w，0.5％至1％w/w，例如约0.75％w/w的浓度存在于组合物中。
68、流动改善剂通常以2％至30％w/w，例如2％至20％、3％至10％或5％至10％w/w的浓度存在于组合物中。
69、稳定剂通常以2％至70％w/w，例如10％至60％w/w、15％至55％w/w、20％至50％w/w、30％w/w至50％w/w、40％至50％w/w，例如约46-47％w/w的浓度存在于组合物中。
70、填充剂通常以2％至70％w/w，例如10％至60％w/w、15％至55％w/w、20％至50％w/w、30％w/w至50％w/w、40％至50％w/w例如约46-47％w/w的浓度存在于组合物中。
71、本发明的疫苗组合物通常含有亮氨酸(作为流动改善剂，其浓度如上所述，如约7％w/w)、海藻糖(作为稳定剂，其其浓度如上所述，如约46.5％w/w)和环糊精或其衍生物(作为填充剂，其浓度如上所述，如约46.5％w/w)。该组合物还含有佐剂(通常为聚ic:lc)和抗原。
72、如上所述，本发明的疫苗组合物还含有佐剂。合适的例子是tlr激动剂，如本文标题为“与tlr激动剂的组合”下讨论的那些。其他合适的佐剂包括rig-1和mda5。rig-1是一种负责1型干扰素(ifn1)应答的胞质模式识别受体。rig-1是先天免疫系统中的一种必需分子，用于识别已感染病毒的细胞。这些病毒包括呼吸道病毒，如甲型流感病毒和冠状病毒。mda5(黑素瘤分化相关蛋白5)是一种rig-1样受体dsrna解旋酶，由人ifih1基因编码。mda5是rig-1样受体(rlr)家族的一部分，该家族还包括rig-1和lgp2，并作为一种能够检测病毒的模式识别受体发挥作用。
73、在实施方案中，tlr激动剂是tlr2激动剂和/或tlr3激动剂，例如tlr激动剂是tlr3激动剂。
74、tlr3激动剂的合适实例选自聚ic和聚ic:lc。
75、基于组合物中干物质(dry matter)的总重量，佐剂如聚ic或聚ic:lc以对应于0.01％至1％w/w，例如0.075％至0.75％w/w的范围，0.08％至0.5％w/w、0.1％至0.4％w/w、0.1％至0.25％w/w的范围，例如约0.15％w/w的浓度存在于在组合物中。
76、如上所述，本发明的疫苗组合物还可以包含维生素a和/或维生素d(见标题“与维生素a的组合”和标题“与维生素d的组合”下的讨论)
77、冠状病毒
78、本发明的疫苗组合物适用于针对冠状病毒疾病如sars-cov2的疫苗接种。
79、其他目的冠状病毒是sars、mers、covid-19、α-、β-、δ-、γ-冠状病毒，以及引起上呼吸道疾病的冠状病毒(29e,oc43,nl63和hku1)。
80、本发明的疫苗组合物包含抗原。抗原可以是蛋白质或其多聚体、肽或其多聚体或减毒病毒或细菌。特别地，抗原是在病毒或细菌表面表达的全长蛋白质。在实施方案中，抗原可以是sars-cov-2的刺突蛋白或其变体，或它可以是减毒的sars-cov-2或其组分，或者是来自sars-cov-2的刺突蛋白或其部分，如包括rbd的sars-cov-2刺突s1亚基。
81、临床前小鼠研究中使用的刺突剂量在5-80μg范围之间。在临床上，计划评估10-120μ，如10μg、50μg和120μg的所述刺突蛋白。佐剂的剂量通常为10μg至120μg。3-60μg范围的聚ic:lc已用于临床前啮齿动物研究。对于临床试验，我们计划使用10-60μg，如20μg或40μg。
82、生产聚ic:lc的oncovir已将其用于临床试验，鼻用剂量达1mg，无不良反应。
83、稀少地评估了维生素a和d，在小鼠研究中，我们每只小鼠已使用200ng calcitrol和40μg atra(全反式视黄酸)。
84、冠状病毒是一组相关的rna病毒，在哺乳动物和鸟类中引起疾病。在人类和鸟类中，它们引起可以从轻度到致命范围的呼吸道感染。人类的轻微疾病包括一些普通感冒的情形(普通感冒也由其他病毒引起，主要是鼻病毒)，而更致命的病毒种类可以引起sars、mers和covid-19。
85、冠状病毒构成利比维里亚界(riboviria)尼多维拉目(nidovirales)冠状病毒科(coronaviridae)中的正冠状病毒(orthocoronavirinae)亚科。它们是包膜病毒，具有正义单链rna基因组和螺旋对称的核衣壳。冠状病毒的基因组大小约为26至32千碱基，是rna病毒中最大的之一。它们具有特征性的棒状刺突突出于它们的表面，在电子显微照片中，这些刺突会产生一种让人联想到日冕的图像，由此衍生出它们的名字。冠状病毒是具有独特表面突起物的大的大致球形粒子。它们的尺寸高度可变，通常平均直径为120nm。已知极端尺寸的直径为50至200nm。总分子量平均为40000kda。它们被包封在一个包埋着许多蛋白质分子的包膜。脂质双层包膜、膜蛋白和核衣壳在病毒离开宿主细胞时保护该病毒。
86、冠状病毒疾病2019(covid-19)是一种由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)引起的传染性呼吸道和血管疾病。
87、covid-19的常见症状包括发烧、咳嗽、疲劳、呼吸困难以及嗅觉和味觉丧失。暴露于病毒后1至14天开始出现症状。虽然大多数人症状轻微，但有些人会患上急性呼吸窘迫综合征(ards)。ards可以由细胞因子风暴、多器官衰竭、感染性休克和血栓引发。已经观察到对器官(特别是肺和心脏)的长期损伤。
88、covid-19通过多种途径传播，主要涉及唾液和其他体液和排泄物。这些液体可以形成小液滴和气溶胶，当感染者呼吸、咳嗽、打喷嚏、唱歌或说话时，小液滴和气溶胶可以传播。这被怀疑是主要的传播方式。该病毒也可能通过受污染的表面和直接接触传播。感染主要发生在人们彼此靠近足够长的时间时。它可以在感染者出现症状前(症状前(presymptomatic))早两天传播，和从无症状(没有症状)的个体传播。在中度病例中，人们保持传染性持续达十天，在重度病例中，人们保持传染性持续达两周。
89、副作用和/或迟发性影响包括疲劳、精力不足、肌肉疼痛、关节疼痛、关节和骨酸痛等中的一种或多种。
90、本发明的疫苗组合物可以与例如维生素a和/或维生素d组合使用。
91、呼吸道病毒可以是流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、偏肺病毒、鼻病毒、冠状病毒、腺病毒、博卡病毒。
92、呼吸道细菌可以是肺炎链球菌、肺炎支原体、流感嗜血杆菌、肺炎嗜衣原体、鹦鹉热衣原体、卡他莫拉菌、结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、海洋分枝杆菌。
93、与tlr激动剂的组合
94、toll样受体(tlrs)是一类在识别病毒粒子和激活先天免疫系统中起重要作用的蛋白质。它们是跨膜受体，通常在巨噬细胞和树突状细胞上表达，并识别衍生自微生物的分子。一旦微生物通过了例如皮肤或粘膜，它们就会被tlr识别，这激活免疫细胞反应。人tlr包括tlr1,tlr2,tlr3,tlr4,tlr5,tlr6,tlr7,tlr8,tlr9,tlr10。人缺乏tlr11、tlr12、tlr13的基因。
95、tlr1、tlr2、tlr4、tlr5、tlr6和tlr10位于细胞膜上，而tlr3、tlr7、tlr8和tlr9位于胞内囊泡中。
96、tlr通路的激活导致促炎细胞因子的分泌，如白细胞介素-1(il-1)、il-6和肿瘤坏死因子-α，以及1型干扰素。不同的tlr，如tlr2、tlr3、tlr4、tlr6、tlr7、tlr8和tlr9，在covid-19感染中是潜在重要的。
97、tlr2激动剂的实例是巨噬细胞活化脂肽(malp-2)、pam2cys、peg-pam2cys。
98、tlr3激动剂的实例是聚ic的pika类似物、聚ic(聚胞苷酸)、聚ic:lc(聚ic与聚-l-赖氨酸和羧甲基纤维素的缩合)和脂质体包封的聚ic:lc。
99、tlr4激动剂的实例是lps(脂多糖)、mpl(单磷酰脂质a)、fimh(菌毛h蛋白)、agp(氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯)
100、tlr5激动剂的实例是细菌鞭毛蛋白。
101、tlr7激动剂的实例是1-(2-甲基丙基)-1h-咪唑并(4,5-c)喹啉-4-胺(咪喹莫特)。
102、tlr9激动剂的实例是cpg和cpg-odn。
103、如上所述，该组合也可以与其他佐剂如rig-1或mda5组合。
104、与维生素a的组合
105、免疫球蛋白a(iga)是五种主要免疫球蛋白之一，在胃肠道、呼吸道和泌尿生殖道的粘膜稳态中发挥着关键作用，在这一作用中作为免疫的主要抗体发挥功能。它是体内发现的第二丰富的免疫球蛋白类型，因此在对抗抗原的保护中起着至关重要的作用。
106、iga是通过ig的类别转换产生的，所述ig的类别转换受多个过程调节。cd40-cd40l的结合和其他细胞因子il-4、il-5、il-6、il-10和il-21的分泌促进th2细胞的成熟，这促进向不同ig亚型的类别转换。视黄酸是维生素a的代谢产物，其也与il-5和il-6协同作用，以诱导iga分泌。
107、维生素a(retinoid)是一种微量营养素，已知在几乎所有脊椎动物的膳食中都需要微量，因为它不能以维持生理健康的足够量来合成。因为已知维生素a和其代谢产物具有佐剂活性，其高浓度可以具有一些治疗作用。
108、视黄醇必须被细胞内酶，即，醇脱氢酶(adh)氧化为视黄醛，然后被视黄醛脱氢酶(raldh)不可逆地分解代谢为其生物活性形式的全反式视黄酸(从现在起称为ra)。这种生物活性代谢产物可以由许多已知具有这种转化所需的raldh酶的细胞类型和组织合成，包括来自不同组织例如肠、肺、皮肤和它们的引流淋巴结的dc。
109、在20世纪80年代，已经发现维生素a控制iga二聚体在上皮细胞中的跨细胞运输。在接下来的几十年里，进一步探讨了维生素a与固有层(lamina propria)中的几种免疫细胞和基质细胞相互作用的影响。
110、粘膜免疫细胞的一个特殊特征是它们的独特粘膜印迹表型(mucosal-imprintingphenotype)，这是产生和分泌iga抗体同种型的后续步骤所需的特性。这种特殊特性似乎需要在粘膜环境中存在ra。关于维生素a(或ra)对粘膜免疫反应调节的影响的关键发现是，ra在dc的分化中起着核心作用，并且粘膜dc可以将视黄醇代谢为视黄酸。
111、ra的另一个重要功能是促进dc依赖性自b细胞产生iga抗体分泌细胞，并且这一过程受iga诱导的细胞因子如il-5/il-6增强。事实上，来自几种动物模型和人类研究的不同证据链都一致认为，需要淋巴组织dc和其他非免疫细胞合成ra，以诱导b细胞中iga表达。从这些研究中得出的结论是，ra作为一种特异性iga同种型转换因子发挥作用，其促进iga+抗体分泌细胞的分化，并在tgf-β存在时增强iga产生。这种作用的有效性受到微环境中存在的il-5或il-6调节。
112、与维生素d的组合
113、一般来说，维生素d具有激活先天免疫系统和抑制适应性免疫系统的作用，具有抗细菌、抗病毒和抗炎作用。缺乏维生素d与包括hiv和covid-19在内的病毒感染风险或严重程度的增加有关。低水平的维生素d似乎是结核病的一个危险因素，并且历史上它被用作一种治疗方法。
114、补充剂略微降低急性呼吸道感染的风险和严重程度，且也缓解哮喘的恶化。没有证据表明维生素d影响五岁以下儿童的呼吸道感染。补充维生素d实质地降低基线25(oh)d水平低于25nmol/l的人群中copd中度或重度加重的发生率，但在那些具有较不严重缺乏的人群则不是这样。
115、因此，维生素d是一种众所周知且安全的用于药物中的活性物质。
116、维生素d是一组脂溶性开环甾类化合物(secosteroid)，已知其增加钙、镁、磷酸盐的肠道吸收和许多其他生物学效应。
117、已知有五种不同的维生素d：维生素d1(也称为麦角钙化醇和光甾醇的1:1混合物)、维生素d2(也称为麦角钙化醇，其可由麦角固醇制备)、维生素d3(也称为胆钙化醇，其可由7-脱氢胆固醇制备)、维生素d4(也称为22-二氢钙化醇)和维生素d5(也称为谷钙化醇，其可由7-脱氢谷甾醇制备)。本发明中使用的维生素d选自维生素d1,维生素d2,维生素d3,维生素d4,维生素d5或它们的混合物。
118、在人类中，最重要的维生素d是维生素d3(胆钙化醇)和维生素d2(麦角钙化醇)。这些统称为钙化醇。维生素d2在1931年进行了化学表征。1935年，维生素d3的化学结构被确定，并证明是来自7-脱氢胆固醇的紫外线照射。
119、从化学上讲，各种形式的维生素d都是开环甾类化合物，即，类固醇环中的一个键被打开的类固醇。维生素d2和维生素d3之间的结构差异在于维生素d2的侧链，该侧链含有在碳22和23之间的双键和在碳24上的甲基。
120、因此，在本发明的组合物中，维生素d2和d3是特别优选的。最优选的是维生素d3。
121、维生素的主要天然来源是通过依赖于光暴露(特别是uvb辐射)的化学反应在皮肤表皮下层合成胆钙化醇。胆钙化醇和麦角钙化醇可以从膳食和补充剂中摄入。只有少数食物，如多脂鱼肉，天然含有大量的维生素d。在美国和其他国家，牛奶和植物衍生的奶替代品富含维生素d，许多早餐谷物也是如此。暴露在紫外线下的蘑菇提供有用量的维生素d。膳食建议通常假设一个人的所有维生素d都是通过口摄入的，因为人群中的阳光暴露是可变的，并且考虑到皮肤癌症风险，关于安全的光暴露量的建议是不确定的。
122、来自膳食或来自皮肤合成的维生素d在生物学上是无活性的。它由两个蛋白酶羟基化步骤激活，第一个在肝脏，第二个在肾脏。如果暴露于足够的阳光下，大多数哺乳动物可以合成足够量的维生素d，因此它不是必需的，所以从技术上讲不是一种维生素。相反地，它可以被视为一种激素，维生素d前体激素的激活产生活性形式骨化三醇，其然后通过多个位置的核受体产生作用。
123、胆钙化醇在肝脏中转化为骨化二醇(calcifediol)(25-羟基胆钙化醇)；麦角钙化醇转化为25-羟基麦角钙化醇。测量血清中的这两种维生素d代谢物(称为25-羟基维生素d或25(oh)d)，以确定一个人的维生素d状态。骨化二醇被肾脏进一步羟基化，形成骨化三醇(也称为1,25-二羟基胆钙化醇)，这是维生素d的生物学活性形式。骨化三醇作为一种激素在血液中循环，在调节钙和磷酸盐的浓度以及促进骨骼的健康生长和重塑方面发挥着重要作用。骨化三醇还有其他作用，包括对细胞生长、神经肌肉和免疫功能的一些作用，以及减轻炎症。
124、维生素d在钙稳态和代谢中具有显著作用。它的发现归因于寻找佝偻病儿童(儿童期骨软化症)缺乏的膳食物质的努力。提供维生素d补充剂来治疗或预防骨软化症和佝偻病。补充维生素d对普通人群的其他健康影响的证据是不一致的。补充维生素d对死亡率的影响尚不清楚，一项荟萃分析发现老年人的死亡率略有下降，另一项结论是，不存在明确的正当理由来建议补充维生素d以预防许多疾病，以及在这些领域不需要进一步研究类似的设计。
125、活性维生素d代谢产物骨化三醇通过与主要位于靶细胞核中的维生素d受体(vdr)结合来介导其生物学效应。骨化三醇与vdr的结合使vdr充当转录因子*，调节转运蛋白(如trpv6和钙结合蛋白(calbindin))的基因表达，这些转运蛋白参与肠中的钙吸收。维生素d受体属于类固醇/甲状腺激素受体的核受体超家族，且vdr由大多数器官中的细胞表达，所述器官包括脑、心脏、皮肤、性腺、前列腺和乳腺。
126、肠、骨、肾和甲状旁腺细胞中的vdr激活导致(在甲状旁腺激素和降钙素(calcitonin)的帮助下)维持血液中的钙和磷水平，并维持骨含量。
127、维生素d最重要的作用之一是通过促进肠中的钙吸收来维持骨骼钙平衡，通过增加破骨细胞数量来促进骨吸收，维持骨形成所需的钙和磷酸盐水平，并允许甲状旁腺激素正常发挥功能来维持血清钙水平。维生素d缺乏可以导致较低的骨矿物质密度，以及可以导致骨密度降低(骨质疏松症)或骨折的风险增加，因为缺乏维生素d改变了体内的矿物质代谢。因此，维生素d作为骨吸收的强效刺激剂，对骨重塑也至关重要。
128、vdr调节细胞增殖和分化。维生素d也影响免疫系统，且vdr在几种白细胞中表达，包括单核细胞和活化的t和b细胞。在体外，维生素d增加肾上腺髓质细胞中酪氨酸羟化酶基因的表达，并影响神经营养因子、一氧化氮合酶和谷胱甘肽的合成。维生素d受体表达随着年龄的增长而降低，且研究结果表明，维生素d与肌肉力量、质量和功能直接相关，所有这些都是运动员成绩表现的重要因素。
129、组合疫苗
130、本发明的疫苗组合物还可以含有两种或多种抗原，例如在病毒表面表达的蛋白质抗原的混合物。这种混合物可以分别来自sars-cov-2变体的刺突与甲型流感和/或乙型流感的血凝素和/或神经氨酸酶的混合，以获得双重或三重组合疫苗组合物。
131、本发明的其他方面
132、本发明还涉及
133、i)疫苗试剂盒，其包含：
134、-包含抗原、tlr激动剂和一种或多种可药用赋形剂的组合物，以及
135、-标签，其告知所述组合物将通过共同施用维生素a用于疫苗接种，
136、ii)i)疫苗试剂盒，其包含：
137、-包含抗原、tlr激动剂和一种或多种可药用赋形剂的组合物，以及
138、-标签，其告知所述组合物将通过共同施用维生素d用于疫苗接种，
139、iii)i)疫苗试剂盒，其包含：
140、-包含抗原、tlr激动剂和一种或多种可药用赋形剂的组合物，以及
141、-标签，其告知所述组合物将通过共同施用维生素a和维生素d用于疫苗接种，
142、iv)疫苗试剂盒，其包含：
143、-第一组合物，所述第一组合物包含抗原、tlr2激动剂和一种或多种可药用赋形剂，以及
144、-第二组合物，所述第二组合物包含维生素a，
145、v)疫苗试剂盒，其包含：
146、-第一组合物，所述第一组合物包含抗原、tlr2激动剂和一种或多种可药用赋形剂，以及
147、-第二组合物，所述第二组合物包含维生素d，
148、vi)疫苗试剂盒，其包含：
149、-第一组合物，所述第一组合物包含抗原、tlr2激动剂和一种或多种可药用赋形剂，以及
150、-第二组合物，所述第二组合物包含维生素a，
151、-第三组合物，所述第三组合物包含维生素d。
152、本发明疫苗的一般用途
153、本文公开的本发明的疫苗接种方法和疫苗组合物可用于向个体提供对细菌或病毒的免疫，特别是对抗本文所述的呼吸道细菌或病毒的免疫。
154、用于疫苗接种来对抗冠状病毒引起的疾病的药物组合物
155、本发明还提供了包含药物组合物的疫苗接种试剂盒，所述药物组合物包含抗原和tlr3激动剂以及一种或多种可药用赋形剂。本发明还涉及肺或鼻内组合物，其包含抗原和tlr3激动剂以及至少一种可药用赋形剂。
156、用于鼻、气管内和肺施用的药物组合物为固体形式。如本文的实施例所示，固体形式可以通过干燥液体制剂获得。配制为粉末用于通过嗅闻施用，但也可以是粉末喷射或干粉吸入剂的形式。
157、疫苗接种方法可以由一段时间内的单次施用或多次施用组成。特别地，维生素a和/或维生素d的口服施用可以由多次施用组成。
158、组合物可以方便地以合适剂型存在，所述合适剂型如单位剂型，并且可以通过药学领域中众所周知的任何方法制备。这类方法包括使活性成分(抗原)和tlr3激动剂与一种或多种赋形剂组合的步骤。通常，通过将活性成分与液体载体或细碎的固体载体或与这两者均匀紧密地组合来制备制剂。
159、取决于特定的疫苗接种和待接种的个体，以及施用途径，组合物可以以不同的剂量和/或频率施用。
160、药物组合物必须在制造和储存条件下是稳定的；因此，根据需要，应保存它们免于微生物如细菌和真菌的污染。在液体制剂作为中间制剂，如溶液、分散体和悬浮液的情况下，载体(carrier)可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、植物油和它们的合适混合物的溶剂或分散体介质。在固体制剂的情况下，通常通过将微粉化的活性颗粒与载体颗粒如本文之前所述的那些载体颗粒(包括hpmc、羟丙基环糊精、山梨醇、乳糖、海藻糖、亮氨酸或甘露醇)混合来制备干粉制剂。
161、组合物还可以包括ph调节剂、稳定剂、表面活性剂、增溶剂(如甘油三乙酸酯、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、二甲基乙酰胺、n-甲基吡咯烷酮、n-羟乙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮)、吸收促进剂(如聚氧乙烯二醇或脂肪酸单或双甘油酯)、分散剂、防腐剂等。
162、应该理解的是，除了上述特别提到的成分之外，本发明的制剂还可以包括本领域常规的与所讨论的制剂类型有关的其他试剂。本领域技术人员将知道如何选择合适的制剂以及如何制备它(参见例如remington’s pharmaceutical sciences，第18版或更高版本)。本领域技术人员还将知道如何选择合适的施用途径和剂量。
163、tlr激动剂的可药用盐包括由可药用无机或有机酸或碱形成的常规盐以及酸加成季铵盐。合适的酸盐的更具体的例子包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富马酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、甲酸、乳酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、棕榈酸、苹果酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、甲苯磺酸、甲烷磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羟基萘甲酸、氢碘酸、苹果酸、固醇酸(steroic acid)、单宁酸等。其他酸如草酸，虽然其本身不可药用，但可用于制备这样的盐，所述盐可用作获得本发明化合物和它们的可药用盐的中间体。合适的碱性盐的更具体的例子包括钠、锂、钾、镁、铝、钙、锌、n,n'-二苄基乙二胺、氯丙卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、n-甲基葡糖胺和普鲁卡因的盐。
164、结果
165、在本文的实施例中可以看到作为用于鼻施用的疫苗组合物的载体的适用性，该疫苗组合物用于对抗呼吸道细菌或病毒的疫苗接种。在本上下文中，载体表示可药用赋形剂以及tlr激动剂，但不包括任何抗原、任何灭活或减毒的病毒或细菌。
166、在实施例3中报道了，刺突蛋白疫苗isr52的呼吸道施用保护免受致命攻击(研究ab21-04、ab21-31)。
167、认为sars-cov-2刺突糖蛋白是针对严重covid-19疾病的保护性免疫的必要抗原。事实上，在世界卫生组织疫苗追踪的临床和临床前研究中，几种基于刺突的亚单位疫苗已显示出有效性。因此，我们根据创始sars-cov-2序列选择可溶性刺突蛋白作为我们的第一候选疫苗，因为我们知道刺突蛋白的干粉制剂可以在以后制备。
168、如实施例3中详细描述的，然后制备我们的候选疫苗(isr52)，用于施用于雌性ac70hace2小鼠，这是一种致命的sars-cov和sars-cov-2感染模型(等人,2020；tseng等人,2007；xu等人,2021；yoshikawa等人,2009)。我们使用低剂量和高剂量的isr52，用聚i:c和全反式视黄酸(atra)作为佐剂。我们测试了三种不同的施用途径：皮下(s.c.)注射、鼻内(i.n.)和气管内(i.t.)途径。虽然之前已经对sars-cov-2疫苗的鼻内免疫进行了查询，但据我们所知，还没有关于气管内施用的报道。我们免疫了每组7或8只小鼠，并包括了未接种疫苗小鼠的额外对照组。间隔两周进行两次免疫，然后我们用2x105tcid50的创始型sars-cov-2进行攻击。
169、攻击后，我们每天监测所有小鼠的健康状况，并在小鼠体重减轻>20％或出现符合我们伦理许可的更严重症状时将小鼠安乐死。根据这些标准，将未接种疫苗的对照组的所有小鼠在感染后第4天安乐死。对于低剂量皮下组，5/7只小鼠在感染后第5或6天死亡，表明次优的保护。我们发现，在所有其他组中100％的保护，包括在较低剂量的i.n.组和i.t.组中，表明isr52提高了对sars-cov-2的保护性免疫。攻击后存活下来的小鼠在bal中没有可量化的sars-cov-2水平，这表明它们在感染后第11天已经清除了感染，或者病毒从未进入肺。肺组织的组织病理学分析显示肺存在炎性细胞，可能表明存在感染，尽管我们没有看到组间的明显差异。最令人感兴趣的是，未接种疫苗(8/8)和低剂量(5/7)和高剂量(2/7)皮下接种组均观察到脑组织炎症和坏死；对通过呼吸道途径接种疫苗的动物没有类似的观察结果。神经元损伤是hace2小鼠模型中sars-cov-2病理学的主要部分，因此，高度相关的是，i.n.和i.t.施用isr52即使在低剂量下，均能保护免于神经元损伤的迹象。
170、在实验结束当天从小鼠收获支气管肺泡灌洗液(bal)和器官。我们分析了安乐死时bal和肺组织中sars-cov-2rna的存在情况(图29)。我们在感染期间死亡的小鼠的bal中检测到sars-cov-2rna，包括对照组小鼠和低剂量s.c.组的4只小鼠。同时，在存活的小鼠中发现了低至不可检测到的病毒rna(ct>35)。我们在肺组织中获得了类似的结果，尽管总体上只有少数动物具有可量化的sars-cov-2rna。这些结果表明，除低剂量s.c.组外，接种疫苗的动物在感染后第11天清除了感染或病毒从未进入肺。我们还研究了受攻击小鼠脑组织病理学的证据，因为神经元损伤是hace2小鼠模型中sars-cov-2病理学的主要部分。组织病理学分析显示，未接种疫苗(8/8)和低剂量(5/7)和高剂量(2/7)皮下接种组的脑组织炎症和坏死；对通过呼吸道途径接种疫苗的动物没有类似的观察结果。这些结果表明，i.n.和i.t.施用isr52即使在低剂量下，均能保护hace2小鼠模型免受神经元损伤的迹象。总之，与低剂量isr52的常规皮下疫苗接种相比较，我们看到呼吸道疫苗接种有明显的益处。
171、isr52免疫诱导与关注的变异毒株交叉反应的体液应答(研究ab21-33、ab21-73)-实施例4和6
172、由于抗刺突抗体在抗sars-cov-2的保护性免疫中可能是重要的，我们还研究了在病毒攻击前收集的接种疫苗的小鼠血清的反应性。我们分析了抗来自九州江城的创始毒株的刺突s1蛋白和抗关注的α变体(voc)b.1.1.7和βvoc b.1.351的受体结合结构域(rbd)的血清igg和血清iga的水平。我们发现，所有接种疫苗的组都具有可检测到的抗刺突igg，直至每种变体至少1:10000的稀释度，高剂量组具有更高的igg水平。当我们分析抗刺突iga时，我们还发现接种组之间的差异更大；然而，与气管内疫苗接种相比，鼻内疫苗接种的血清iga应答更强，而皮下疫苗接种的iga滴度可以忽略不计。由于鼻内和气管内免疫的目的之一是在相关感染部位诱导局部免疫应答，我们还在安乐死时从动物收获了bal。我们分析了bal中抗刺突iga的存在，发现高剂量鼻内组最强诱导iga，皮下组诱导作用很小，气管内组诱导作用弱。当我们分析bal中存在的抗体的中和能力时，这种模式得到了再现。我们发现皮下免疫与bal的中和活性无关(低剂量组和高剂量组的13只动物中有1只具有可检测的中和抗体滴度)。然而，我们可以发现，44％的鼻内组和气管内组具有可检测的中和抗体水平，滴度高达1/32(低剂量i.n.2/8；高剂量i.n.5/7；低剂量i.t.1/7；高剂量i.t.4/5)。
173、结合存活率和脑组织病理学数据，这些数据表明，与s.c.免疫相比，i.n.和i.t.施用产生了更强劲的保护作用。这些结果与之前的鼻内疫苗接种研究一致，但首次证明了气管内免疫对抗sars-cov-2的有效性。
174、实施例5涉及对用变体刺突更新的候选疫苗isr52的剂量依赖性应答(研究ab21-31)。
175、我们的第一个攻击研究表明，当鼻内或气管内施用时，候选疫苗isr52有望诱导抗体并保护免于sars-cov-2疾病。在主要循环变体及它们的可能免疫逃逸突变发生变化后，我们更新了我们的候选疫苗，以包括等量的单体α变体刺突(b.1.1.7)和β变体刺突(b.1.351)。我们专注于i.n.和i.t.免疫，在这项研究中使用5μg和20μg的刺突总量，与之前的研究中使用10μg和80μg进行比较(表3)。我们使用了与之前研究相同的免疫接种和攻击日程安排(图2a)，每组免疫11只雌性hace2小鼠。为了挑战我们的候选疫苗的能力，我们使用了更高感染剂量的sars-cov-2(1x106 tcid50)。与之前的研究一样，所有未接种疫苗的对照小鼠体重减轻，出现其他症状，并在感染后第4天被安乐死。不幸的是，设备故障导致高剂量鼻内组4只小鼠在感染后2天死亡；认为这些小鼠的死亡与感染无关，因此将它们排除在进一步分析之外。低剂量组显示出该疫苗的适度效果；感染后低剂量i.n.组的3/11和低剂量i.t.组的4/11存活，而将其余动物在第4、5或6天安乐死。到感染后第4天，这两组小鼠平均显著下降了它们的体重。高剂量组显示出更高的保护水平，其中i.n.组的4/7和i.t.组的7/11在攻击后存活。与此一致的是，我们没有观察到这些小鼠的体重显著下降。因此，我们的疫苗具有明显的剂量依赖性，尽管通过分析健康状况和存活率，我们没有看到施用途径之间的差异。我们分析了安乐死时小鼠bal中的sars-cov-2rna，并在实验结束前被安乐死的大多数动物中发现了可检测水平；将存活的动物在感染后11天安乐死，且没有可检测到的sars-cov-2rna水平。总体而言，我们的改良候选疫苗对来自与接种小鼠不同的毒株的高剂量病毒显示出良好的有效性；这在较高的20μg剂量下，i.n.和i.t.施用都是如此。
176、攻击前和攻击后的抗体应答在i.n.和i.t.施用之间没有显著性差异(研究ab21-33,ab21-34,ab21-74)
177、在这项研究中，我们在第一次免疫后、在第二次免疫后以及预期的终点时收获并分析了血清，一次免疫产生了弱的抗刺突igg反应。第二次免疫明显导致抗刺突igg滴度以剂量依赖的方式强增加，支持我们的双剂量策略，但我们没有看到免疫途径(i.n.与i.t.)之间的差异。然后，我们观察了二次免疫后，血清igg和血清iga对来自关注的α、β和δ(b.1.617.2)变异毒株以及正在监测的κ(b.1.617.1)变异毒株的四种变体刺突蛋白的交叉反应性。尽管使用α和β刺突蛋白组合进行免疫，但我们发现抗组内所有变体刺突蛋白的igg和iga水平相似。在组间，我们看到了剂量依赖性的证据，但相同剂量的i.n.组和i.t.组之间也没有显著的不同。
178、为了补充我们的血清学数据，我们汇集了每个疫苗组的攻击前血清，并分析了血清抗β变体(小鼠已特异性免疫β变体)和δ变体(小鼠未免疫δ变体)的中和活性。我们再次观察到i.n.和i.t.施用的剂量依赖性效应。当比较相同剂量时，i.n.和i.t.疫苗接种抗β变体的中和滴度相同，与抗β刺突蛋白的血清学数据一致。类似地，高剂量i.n.组和i.t.组抗δ毒株的滴度均为1/64。观察到与低剂量组的唯一潜在差异；低剂量气管内施用抗δ变体的滴度为1/32，但在低剂量鼻内组中没有可检测到的中和抗体，检测限为1/16。我们还分析了bal对创始毒株的中和作用。我们在大多数受保护的小鼠中发现了中和抗体，但在易感小鼠中没有发现中和抗体。这种强相关性表明，疫苗在气道中诱导免疫应答的能力对于疫苗保护免于严重感染和死亡的能力是重要的。与此同时，尽管高的病毒感染剂量，但我们没有看到鼻内和气管内免疫之间的显著差异。这可能是“共有的粘膜免疫”现象的结果，其中在一个粘膜部位的免疫导致远端部位的免疫。我们现在计划将我们的疫苗开发为吸入性干粉，并推进i/ii期临床试验。
179、基于变体刺突的候选疫苗isr52的剂量依赖性应答
180、在主要循环变体及它们的可能免疫逃逸突变发生变化后，我们更新了我们的候选疫苗，以包括等量的α变体和β变体刺突s1。我们使用了i.n.和i.t.施用途径，并决定将剂量降低至总刺突s1的5和20μg，这次每组免疫11只雌性hace2小鼠。在这项研究期间，我们收获并分析了第一次和第二次免疫后的血清。正如预期的那样，一次免疫接种产生弱的抗刺突igg反应。第二次免疫明显导致抗刺突igg滴度以剂量依赖的方式强增加，支持我们的两剂策略；然而，没有观察到免疫途径(i.n.相对于i.t.)之间的差异。然后，我们研究了两次免疫后血清igg和血清iga对三种变体刺突rbd的交叉反应性，这些变体来自关注的α、β和δ变异毒株。尽管用α和β刺突s1蛋白的组合进行免疫，但我们观察到组内抗所有变异rbd的igg和iga水平相似(图3c,s3a,s3b,s3c,s3d,s3e,s3f,s3g)。在各组之间，我们看到了剂量依赖性的证据，但相同剂量的i.n.组和i.t.组之间也没有显著差异。
181、这些血清学数据得到了每组合并的攻击前血清中和活性分析的补充。我们发现，在来自i.n.组和i.t.组的接种疫苗的小鼠中，以剂量依赖的方式中和了β和δ变种。较高剂量20μgi.n.组和i.t.组对β和δ变种的中和滴度分别为1:128和1:64，与我们的血清学数据一致(图s3b、s3c)。低剂量组观察到唯一潜在差异；低剂量i.t.显示对δ变体的滴度为1/32，但在低剂量i.n.组中没有检测到中和抗体，检测限为1/16。
182、在用我们更新的疫苗观察到明显的攻击前免疫应答后，我们决定通过使用比第一次攻击研究更高感染剂量的sars-cov-2(1x106 tcid50)来挑战我们候选疫苗的威力。与第一次攻击研究一样，所有未接种疫苗的对照小鼠体重减轻，出现症状，并在感染后第4天被安乐死。不幸的是，设备故障导致高剂量鼻内组4只小鼠在感染后2天死亡；认为这些小鼠的死亡与感染无关，因此将它们排除在进一步分析之外。低剂量组显示出该疫苗的适度效果；感染后低剂量i.n.组的3/11和低剂量i.t.组的4/11存活，而将其余动物在第4、5或6天安乐死。到感染后第4天，这两组小鼠平均显著下降了它们的体重。高剂量组显示出更高的保护水平，其中i.n.组的4/7和i.t.组的7/11在攻击后存活。与此一致的是，我们没有观察到这些小鼠的体重显著下降。因此，我们的疫苗具有明显的剂量依赖性，尽管通过分析健康状况和存活率，我们没有看到施用途径之间的差异。
183、最后，我们分析了终点时收获的bal中的中和活性。我们在大多数受保护的小鼠中发现了中和抗体，但在易感小鼠中没有发现中和抗体。这种强相关性表明，疫苗在气道中诱导免疫应答的能力对于其保护免于严重感染和死亡的能力是重要的。与此同时，尽管高的病毒感染剂量，但我们没有看到鼻内和气管内免疫之间的显著差异。这可能是“共有的粘膜免疫”现象的结果，其中在一个粘膜部位的免疫导致远端部位的免疫。
184、基于α刺突的isr52揭示了鼻内施用诱导长期t细胞和广泛的交叉反应性抗体应答。
185、初步结果显示，仅基于α变种的刺突s1的疫苗应导致广泛的交叉反应性免疫应答。因此，将该疫苗更新为仅基于刺突s1α作为抗原，并评估了抗体和t细胞应答。在这项研究中，我们集中于雌性c57bl/6j(黑色6)小鼠的i.n.免疫和i.t.免疫，使用总量5μg和20μg的刺突s1。我们在第0天和第14天对每组5或6只小鼠进行免疫接种，并在第28天收获血液、bal和脾细胞。血清中的刺突igg水平是剂量依赖的，并与创始毒株、αvoc、δvoc(b.1.617.2)和奥密克戎voc(b.1.1)的rbd交叉反应。我们发现bal iga也有类似的广泛应答模式，表明在任何病毒暴露之前，相关组织中诱导抗刺突iga，从而证实我们的免疫策略导致诱导局部免疫应答。
186、t细胞应答在引发针对严重covid-19疾病的长期交叉保护上可能是重要的。还显示了，在仓鼠和小鼠模型中，在没有可检测到的中和抗体的情况下，t细胞应答保护免受致命的sars-cov-2攻击。因此，我们研究了isr52是否可以引起刺突肽反应性t细胞。第二次免疫后两周，我们刺激了来自小鼠的t细胞，并在所有i.n.施用的小鼠中通过elispot发现产生ifn-γ和il-2的t细胞，这与之前对covid-19鼻内疫苗的分析一致。i.t.免疫的较少小鼠显示出这些应答，这可能表明鼻内施用在产生t细胞应答上更有效。我们通过细胞内细胞因子染色分析ifn-γ反应的t细胞时发现了类似的模式，在较高i.n.剂量组中发现了cd4+和cd8+群体。
187、接下来，我们重复了c57bl/6j小鼠的免疫接种，以便在更长的时间期间跟踪t细胞应答。在接种疫苗后6个月，我们继续观察到较高i.n.组中显著的cd8+t细胞应答，并观察到cd4+t细胞应答的类似趋势。对于亚单位疫苗来说，诱导强烈而持久的cd8+t细胞应答通常是一个挑战。此外，疫苗接种后6个月，抗体水平维持在高水平。
188、总的来说，我们的isr52候选疫苗与免疫小鼠毒株不同的毒株的高剂量病毒显示出好的有效性；这在较高的20μg刺突s1剂量下，i.n.和i.t.施用都是如此。此外，显示了在交叉反应性抗体和长期刺突肽特异性t细胞应答方面都表现出广泛的免疫应答。基于这些有前景的病毒攻击、血清学和细胞免疫学数据，我们正在推进isr52的干粉制剂，用于i/ii期临床试验中的鼻施用或吸入。
189、概述
190、应当理解，上文结合本发明的化合物或组合物或任何其他方面讨论的任何特征和/或方面通过类比适用于本文所述的方法和用途。
191、下面提供以下附图和实施例来阐述本发明。它们旨在阐述，不应解释为以任何方式进行限制。
1.一种颗粒形式的载体组合物，用作衍生自呼吸道病毒或呼吸道细菌的抗原材料的载体，其中所述载体组合物包含一种或多种可药用赋形剂和佐剂，其中所述一种或多种可药用赋形剂包含i)选自海藻糖、蔗糖和乳糖的二糖，ii)选自环糊精的多糖，并且其中所述佐剂是tlr激动剂。
2.根据权利要求1所述使用的载体组合物，用作衍生自病毒的抗原材料的载体。
3.根据权利要求1或2所述使用的载体组合物，其中所述二糖是海藻糖，所述多糖是羟丙基-β-环糊精，且所述tlr激动剂是tlr3激动剂。
4.根据前述权利要求中任一项所述使用的载体组合物，其中所述二糖的浓度在10％至60％w/w的范围，例如30％至55％w/w或40％至50％w/w的范围。
5.根据前述权利要求中任一项所述使用的载体组合物，其中所述多糖的浓度在10％至60％w/w的范围，例如30％至55％w/w或40％至50％w/w的范围。
6.根据前述权利要求中任一项所述使用的载体组合物，其中所述佐剂的浓度为0.1％至5％w/w。
7.一种疫苗组合物，用于通过向受试者鼻内或肺施用所述组合物来预防致病性呼吸道病毒或致病性呼吸道细菌的感染，其中所述组合物包含来自致病性呼吸道病毒或致病性细菌的抗原材料，并且其中所述组合物包含一种或多种糖和tlr激动剂。
8.根据权利要求7所述使用的组合物，其是具有2至50μm范围的平均粒度的颗粒形式。
9.根据权利要求7或8所述使用的组合物，其中所述一种或多种糖选自海藻糖和环糊精，或它们的混合物。
10.根据权利要求7-9中任一项所述使用的组合物，其包含羟丙基-β-环糊精。
11.根据权利要求7-10中任一项所述使用的组合物，其中所述tlr激动剂是选自聚ic和聚ic:lc的tlr3激动剂。
12.根据权利要求7-11中任一项所述使用的组合物，其中所述组合物包含载体组合物以及衍生自致病性呼吸道病毒或致病性呼吸道细菌的抗原材料。
13.一种疫苗组合物，其包含衍生自致病性呼吸道病毒或致病性呼吸道细菌的抗原材料和一种或多种可药用赋形剂，其中所述组合物是具有2至50μm范围的平均粒度的颗粒形式，并且其中所述组合物包含一种或多种糖和tlr激动剂。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述一种或多种糖选自海藻糖和环糊精，或它们的混合物。
15.根据权利要求13或14所述的组合物，其包含羟丙基-β-环糊精。
16.根据权利要求13-15中任一项所述使用的组合物，其中所述tlr3激动剂选自聚ic和聚ic:lc。
17.根据权利要求13-16中任一项所述的疫苗组合物，其包含一种或多种可药用赋形剂，以确保流动性、确保蛋白质结构、确保蛋白质稳定性、避免颗粒内的内聚性和/或避免聚集。
18.根据权利要求13-17中任一项所述的疫苗组合物，其中所述呼吸道病毒选自流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、偏肺病毒、鼻病毒、冠状病毒、腺病毒和博卡病毒。
19.根据权利要求13-18中任一项所述的疫苗组合物，其中所述呼吸道病毒是冠状病毒。
20.根据权利要求13-17中任一项所述的疫苗组合物，其中所述呼吸道细菌选自肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)、肺炎支原体(mycoplasma pneumonia)、流感嗜血杆菌(haemophilus influenza)、肺炎嗜衣原体(chlamydophilia pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(chlamydia psittaci)、卡他莫拉菌(moraxella catarrhalis)、结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)、鸟分枝杆菌(mycobacterium avis)和海洋分枝杆菌(mycobacterium marinum)。
21.根据权利要求13-20中任一项所述的疫苗组合物，其设计用于鼻施用。
22.根据权利要求13-21中任一项所述的疫苗组合物，其中所述平均粒度是20至50μm的范围，例如30至40μm，并且粒度分布显示小于10％的颗粒具有10μm或更小的粒度。
23.根据权利要求13-20中任一项所述的疫苗组合物，其设计用于吸入。
24.根据权利要求13-20、23中任一项所述的疫苗组合物，其中所述平均粒度为10μm或更小，例如最多8μm、最多6μm、最多5μm，或在1μm至5μm的范围，例如在3μm至5μm的范围。
25.根据权利要求13-24中任一项所述的疫苗组合物，当根据欧洲药典10.0中2.9.16所述的方法使用直径为10±0.01mm的无杆漏斗和喷嘴1测量时具有合适的流动性。
26.根据权利要求13-25中任一项所述的疫苗组合物，其中所述一种或多种可药用赋形剂选自纤维素、纤维素衍生物、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、包括单糖、二糖、低聚糖、多糖的糖、包括肽的氨基酸、及它们的混合物。
27.根据权利要求13-26中任一项所述的疫苗组合物，其中所述一种或多种可药用赋形剂选自二糖、低聚糖、氨基酸、肽和多肽。
28.根据权利要求27所述的疫苗组合物，其中所述二糖选自海藻糖、蔗糖、乳糖。
29.根据权利要求28所述的疫苗组合物，其中所述二糖是海藻糖。
30.根据权利要求27所述的疫苗组合物，其中所述低聚糖是环糊精。
31.根据权利要求30所述的疫苗组合物，其中所述环糊精是β-环糊精，例如羟丙基-β-环糊精。
32.根据权利要求27所述的疫苗组合物，其中所述氨基酸选自亮氨酸或赖氨酸和/或所述肽选自三亮氨酸或三赖氨酸，和/或所述多肽选自聚亮氨酸或聚赖氨酸。
33.根据权利要求13-32中任一项所述的疫苗组合物，其进一步包含佐剂。
34.根据权利要求13-33中任一项所述的疫苗组合物，其进一步包含tlr激动剂。
35.根据权利要求35所述的疫苗组合物，其中所述tlr激动剂是tlr2激动剂和/或tlr3激动剂。
36.根据权利要求34或35所述的疫苗组合物，其中所述tlr激动剂是tlr3激动剂。
37.根据权利要求33-36中任一项所述的疫苗组合物，其中所述tlr激动剂是选自聚ic和聚ic:lc的tlr3激动剂。
38.根据权利要求13-37中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含根据权利要求1-6中任一项所述的载体组合物以及衍生自致病性呼吸道病毒或致病性呼吸道细菌的抗原材料。
39.根据权利要求13-38中任一项所述的疫苗组合物，其进一步包含维生素a和/或维生素d，或与维生素a和/或d的单独组合物组合。
