本发明总体上涉及用于治疗疾病的调控前体mrna剪接的肽缀合的反义治疗剂，特别是用于治疗杜氏肌营养不良症(dmd)和脊髓性肌萎缩症(sma)的肽缀合的反义治疗剂。
背景技术：
1、反义治疗剂通过诱导外显子剪接或通过与前信使rna结合抑制外显子剪接功能来调控前信使rna剪接，已被批准用于治疗各种疾病，包括杜氏肌营养不良症和脊髓性肌萎缩症。
2、杜氏肌营养不良症(dmd)是一种致命的x连锁隐性障碍，由dmd基因突变引起，这导致肌肉中缺乏肌营养不良蛋白。肌营养不良蛋白通过形成膜相关糖蛋白复合物将细胞骨架肌动蛋白桥接到细胞外基质来稳定肌膜[1,2]。肌营养不良蛋白丧失会导致全身肌肉逐渐退化，在十几岁之前失去行走能力，在二十几岁时出现心肺功能障碍，通常会导致死亡[3]。每100,000名雄性新生儿中就有19.8名患有dmd，是全世界最常见的遗传性神经肌肉障碍[4]。
3、大多数患者(约70％)在dmd中有大的框外缺失[5]。基于外显子跳跃的治疗剂基于这样的观察，即至少约90％的时间，dmd的框内突变产生较轻微的表型，如becker肌营养不良症(bmd)中所发现的[5,6]。通过使用反义寡核苷酸从dmd转录物中排除框外外显子，外显子跳跃将框外突变转化为框内突变，产生截短但部分有功能的肌营养不良蛋白。四种外显子跳跃治疗剂已获得美国fda批准：eteplirsen/exondys 51(sarepta)[7]、golodirsen/vyondys 53(sarepta)[8]、viltolarsen/viltepso(ns pharma)[9]和casimer sen/amondys45(sarepta)[10]。全部都是磷酰二胺吗啉代寡聚体(pmo)反义寡核苷酸。
4、然而，由于dmd的突变特异性，单外显子跳跃的适用性有限。上述疗法最多只能治疗所有患者的8-13％[11]。多外显子跳跃克服了这个问题，特别是跳跃外显子45-55。外显子45-55是dmd基因中的突变热点，患者中66％的大(≥1个外显子)缺失和15％的大重复(5)。理论上，外显子45-55跳跃可以治疗超过40％的所有dmd患者[12]。
5、外显子45-55的缺失也通常与无症状至轻度表型有关。在leiden dmd数据库中，外显子45-55缺失的90％患者患有bmd；在其他数据库中，包括umd-treat-nmd和临床研究，在所有检查病例中，缺失与bmd或无症状个体有关[12-15]。
6、已经开发出外显子45-55跳跃混合物，其恢复营养不良小鼠肌肉中的肌营养不良蛋白合成[16]。已经开发出一种在永生化患者肌管和人源化dmd小鼠中跳跃人dmd外显子45-55的pmo混合物[13,17]。观察到的平均跳跃效率分别为27-61％和15-22％，治疗在体外产生了高达正常水平14％的肌营养不良蛋白[13,17]。然而，这种混合物每个外显子使用一个pmo(外显子48除外，它需要两个)来跳跃外显子45-55。由于所有pmo必须存在于相同的细胞核中以诱导跳跃外显子45-55，因此功效降低，脱靶效应增加。
7、基于pmo的外显子跳跃疗法的功效受到其从血液中快速清除、肌肉吸收不良以及无法从内体逃逸的影响[19,20]。例如，在接受30或50mg/kg/周剂量治疗180周后，eteplirsen仅使患者的肌营养不良蛋白恢复到正常水平的0.93％[7]。
8、因此，需要改进外显子跳跃疗法来治疗杜氏肌营养不良症。
9、脊髓性肌萎缩症(sma)是一种破坏性的神经退行性障碍，影响脊髓前角的运动神经元[45]。sma可导致进行性肌肉无力、呼吸窘迫甚至瘫痪，是婴儿死亡的主要遗传原因之一[46]。sma的特征是端粒运动神经元1(smn1)基因的存活突变，导致其纯合缺失[47]。smn蛋白的完全丧失在胚胎上是致命的[48,49]。人类拥有smn1的旁系同源物smn2，使患者能够出生[47,50]。然而，由于外显子7中的c转换到t，smn2不能完全补偿smn1丧失，导致其被排除在外。
10、虽然全长smn2(fl-smn2)转录物可以产生稳定的功能蛋白(约10％)，但没有外显子7的转录物(δ7smn2)是不稳定的，产生的蛋白质会迅速降解(约90％)[51]。smn2外显子7的排除是由于与阻遏蛋白hnrnp a1(异质核糖核蛋白a1)结合的iss-n1(内含子剪接沉默子n1)[52-54]。
11、所有sma患者都缺乏功能性smn1基因，因此依赖于smn2基因产生生存所需的smn蛋白。因此，smn2的拷贝数是sma的有效遗传修饰因子，其拷贝数与sma的严重程度呈负相关[55,56]。smn2无法补偿smn1丧失是运动神经元优先退化的原因[51,57]。尽管sma的病理特征是运动神经元退化，但最近的研究强调了外周组织的缺陷[58-60]。此外，体内小鼠研究报告了心动过缓和扩张型心肌病，随着smn水平的恢复而改善[61-63]。虽然原因尚不清楚，但运动神经元特别容易丧失smn[64]。
12、目前，三种sma修饰疗法已获得美国食品和药物管理局(fda)批准：nusinersen(商品名spinraza)、onasemnogene abeparvovec(商品名zolgensma)和risdiplam(商品名evrysdi)。然而，这三种药物有几个相关的问题。onasemnogene abeparvovec是一种基因治疗药物，仅批准用于2岁以下的患者[65]。risdiplam是一种口服小分子药物。然而，由于其对前体mrna剪接的相关脱靶效应，存在安全问题[66]。
13、nusinersen是一种剪接切换反义寡核苷酸(ao)，具有2'-o-甲氧基乙基(moe)硫代磷酸酯化学性质。它通过靶向iss-n1调控smn2剪接，并促进外显子7的包含。由于nusinersen不能穿过血脑屏障(bbb)，因此需要重复鞘内给药，以确保smn蛋白主要强健地恢复至中枢神经系统(cns)组织[67]。尽管提供了安全性，但近三分之一的治疗患者患有脊柱侧弯、持续的腰椎漏液、血小板减少症和其他凝血缺陷[68,69]。
14、为了克服与鞘内注射相关的问题，已经研究了几种ao化学物质和修饰，例如磷酰二胺吗啉代寡聚体(pmo)、锁定核酸(lna)和限制乙基(c-et)[70]。不带电的骨架、低蛋白结合亲和力和核酸酶稳定性使pmo化学物质成为理想的候选者，因为多项研究表明，可以以最小的毒性实现多次高剂量施用[70,71]。然而，与pmo相关的主要缺陷是疗效低，这与其从血液中快速清除、在骨骼肌等组织中吸收不良以及内体捕获有关[72,73]。为了改善pmo向靶组织中细胞核的递送并减少施用剂量，正在研究许多细胞穿透肽(cpp)缀合的pmo。其中一些肽促进pmo穿过bbb，从而确保非侵入性施用治疗神经元障碍的可能性[74]。hammond等人表明，将来自pmo内化肽(pip)家族的肽pip6a全身施用到成年小鼠体内，增加了fl-smn2在外周和cns组织中的表达[71]。然而，ao在cns中的定位和分布仍然未知。此外，已知pip肽具有高毒性[74]。
15、因此，需要改进的剪接调控疗法来治疗脊髓性肌萎缩症。
技术实现思路
1、本发明提供了用于治疗疾病的调控前体mrna剪接的肽缀合的反义治疗剂。
2、在本发明的一方面，提供了一种缀合物，其包含附接到细胞穿透肽(cpp)的能够调控前体mrna的外显子剪接的反义寡核苷酸，所述细胞穿透肽包含以下氨基酸序列：
3、yarvrrrgprgyarvrrrgprr；
4、大写：l-氨基酸，小写：d-氨基酸。
5、在本发明的另一方面，提供了一种缀合物，其包含共价附接到细胞穿透肽(cpp)的能够诱导人肌营养不良蛋白中外显子跳跃的反义寡核苷酸，所述细胞穿透肽包含以下氨基酸序列：
6、yarvrrrgprgyarvrrrgprr；
7、大写：l-氨基酸，小写：d-氨基酸。
8、在一些实施方式中，能够诱导人肌营养不良蛋白中外显子跳跃的缀合物具有反义寡核苷酸，该反义寡核苷酸结合人肌营养不良蛋白前体mrna的外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54和/或外显子55中的靶标。
9、在一些实施方式中，能够诱导人肌营养不良蛋白中外显子跳跃的缀合物具有反义寡核苷酸，其包含或由以下寡核苷酸中的任一个组成：
10、5′-aaaacgccgccatttctcaacagatctgtc-3′、
11、5′-gacaacagtttgccgctgcccaatgccatc-3′、
12、5′-agttgctgctcttttccaggttcaagtggg-3′、
13、5′-gtttgagaattccctggcgcaggggcaact-3′、
14、5′-caatttctccttgtttctcaggtaaagctc-3′、
15、5′-cagatgatttaactgctcttcaaggtcttc-3′、
16、5′-atctcttccacatccggttgtttagcttga-3′、
17、5′-gtaaacggtttaccgccttccactcagagc-3′、
18、5′-gtgtcaccagagtaacagtctgagtaggag-3′、
19、5′-ggtaatgagttcttccaactggggacgcct-3′、
20、5′-cctccggttctgaaggtgttcttgtacttc-3′、
21、5′-gagaagtttcagggccaagtcatttgccac-3′和
22、5′-tcttccaaagcagcctctcgctcactcacc-3′。
23、根据本发明的另一方面，提供了一种组合物，其包含第一缀合物，所述第一缀合物包含共价附接到细胞穿透肽(cpp)的能够诱导人肌营养不良蛋白中外显子跳跃的第一反义寡核苷酸，所述细胞穿透肽包含以下氨基酸序列：
24、yarvrrrgprgyarvrrrgprr；
25、大写：l-氨基酸，小写：d-氨基酸，以及第二缀合物，所述第二缀合物包含共价附接到细胞穿透肽(cpp)的能够诱导人肌营养不良蛋白中外显子跳跃的第二反义寡核苷酸。
26、在一些实施方式中，该组合物还包含至少一种其他缀合物，该缀合物包含共价附接到细胞穿透肽(cpp)的能够诱导人肌营养不良蛋白中外显子跳跃的另一种反义寡核苷酸。
27、在一些实施方式中，能够诱导人肌营养不良蛋白中多外显子跳跃的组合物包含靶向外显子45的肽缀合的反义寡核苷酸、靶向外显子46的肽缀合的反义寡核苷酸、靶向外显子47的肽缀合的反义寡核苷酸、靶向外显子48的肽缀合的反义寡核苷酸、靶向外显子49的肽缀合的反义寡核苷酸、靶向外显子50的肽缀合的反义寡核苷酸、靶向外显子51的肽缀合的反义寡核苷酸、靶向外显子52的肽缀合的反义寡核苷酸、靶向外显子53的肽缀合的反义寡核苷酸、靶向外显子54的肽缀合的反义寡核苷酸和靶向外显子55的肽缀合的反义寡核苷酸。
28、在一些实施方式中，能够诱导人肌营养不良蛋白中多外显子跳跃的组合物包含靶向外显子45的肽缀合的反义寡核苷酸、靶向外显子47的肽缀合的反义寡核苷酸、靶向外显子49的肽缀合的反义寡核苷酸、靶向外显子51的肽缀合的反义寡核苷酸、靶向外显子53的肽缀合的反义寡核苷酸和靶向外显子55的肽缀合的反义寡核苷酸。
29、在一些实施方式中，能够诱导人肌营养不良蛋白中多外显子跳跃的组合物包含靶向外显子45的肽缀合的反义寡核苷酸、靶向外显子47的肽缀合的反义寡核苷酸和靶向外显子53的肽缀合的反义寡核苷酸。
30、根据本发明的一方面，提供了一种治疗患有dmd的受试者的方法，其包括施用治疗有效量的一种或多种能够诱导人肌营养不良蛋白中外显子跳跃的本发明的肽缀合物。
31、根据本发明的另一方面，提供了一种缀合物，其包含共价附接到细胞穿透肽(cpp)的能够诱导人smn2基因中外显子包含的反义寡核苷酸，所述细胞穿透肽包含以下氨基酸序列：
32、yarvrrrgprgyarvrrrgprr；
33、大写：l-氨基酸，小写：d-氨基酸。
34、在一些实施方式中，包含能够诱导人smn2基因中外显子包含的反义寡核苷酸的缀合物与smn2前体mrna的内含子剪接沉默子n1结合。
35、在一些实施方式中，包含能够诱导人smn2基因中外显子包含的反义寡核苷酸的缀合物包括反义寡核苷酸，其包含或由序列5′-tcactttcataatgctgg-3′组成，并且其中胸腺嘧啶任选地被尿嘧啶替换，任选地其中反义寡核苷酸是磷酰二胺吗啉代寡聚体。
36、根据本发明的另一方面，提供了一种治疗受试者的脊髓性肌萎缩症(sma)的方法，其包括施用治疗有效量的本发明的包含能够诱导人smn2基因中外显子包含的反义寡核苷酸的缀合物。
37、根据本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，其包含一种或多种本发明的肽缀合物和药学上可接受的赋形剂。
1.一种缀合物，其包含附接到细胞穿透肽(cpp)的能够调控前体mrna的外显子剪接的反义寡核苷酸，所述细胞穿透肽包含以下氨基酸序列：
2.如权利要求1所述的缀合物，其中所述反义寡核苷酸能够调控人肌营养不良蛋白前体mrna或smn2前体mrna的外显子剪接。
3.一种缀合物，其包含共价附接到细胞穿透肽(cpp)的能够诱导人肌营养不良蛋白中外显子跳跃的反义寡核苷酸，所述细胞穿透肽包含以下氨基酸序列：
4.如权利要求3所述的缀合物，其中所述反义寡核苷酸结合人肌营养不良蛋白前体mrna的外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54和/或外显子55中的靶标。
5.如权利要求3所述的缀合物，其中所述反义寡核苷酸包含或由以下寡核苷酸中的任一个组成：
6.一种组合物，其包含第一缀合物，所述第一缀合物包含共价附接到细胞穿透肽(cpp)的能够诱导人肌营养不良蛋白中外显子跳跃的第一反义寡核苷酸，所述细胞穿透肽包含以下氨基酸序列：
7.如权利要求6所述的组合物，其还包含至少一种其他缀合物，所述缀合物包含共价附接到细胞穿透肽(cpp)的能够诱导人肌营养不良蛋白中外显子跳跃的另一种反义寡核苷酸。
8.如权利要求7所述的组合物，其包含靶向外显子45的肽缀合的反义寡核苷酸、靶向外显子46的肽缀合的反义寡核苷酸、靶向外显子47的肽缀合的反义寡核苷酸、靶向外显子48的肽缀合的反义寡核苷酸、靶向外显子49的肽缀合的反义寡核苷酸、靶向外显子50的肽缀合的反义寡核苷酸、靶向外显子51的肽缀合的反义寡核苷酸、靶向外显子52的肽缀合的反义寡核苷酸、靶向外显子53的肽缀合的反义寡核苷酸、靶向外显子54的肽缀合的反义寡核苷酸和靶向外显子55的肽缀合的反义寡核苷酸。
9.如权利要求7所述的组合物，其包含靶向外显子45的肽缀合的反义寡核苷酸、靶向外显子47的肽缀合的反义寡核苷酸、靶向外显子49的肽缀合的反义寡核苷酸、靶向外显子51的肽缀合的反义寡核苷酸、靶向外显子53的肽缀合的反义寡核苷酸和靶向外显子55的肽缀合的反义寡核苷酸。
10.如权利要求7所述的组合物，其包含靶向外显子45的肽缀合的反义寡核苷酸、靶向外显子47的肽缀合的反义寡核苷酸和靶向外显子53的肽缀合的反义寡核苷酸。
11.如权利要求7所述的组合物，其包含：
12.如权利要求7所述的组合物，其包含：
13.如权利要求7所述的组合物，其包含：
14.如权利要求7所述的组合物，其包含：
15.如权利要求7所述的组合物，其包含：
16.一种药物组合物，其包含如权利要求1至5中任一项所述的肽缀合物或如权利要求6至15所述的组合物，以及药学上可接受的赋形剂。
17.一种治疗患有dmd的受试者的方法，其包括：施用治疗有效量的如权利要求1至5中任一项所述的肽缀合物或如权利要求6至15所述的组合物。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述受试者是人。
19.一种缀合物，其包含共价附接到细胞穿透肽(cpp)的能够诱导人smn2基因中外显子包含的反义寡核苷酸，所述细胞穿透肽包含以下氨基酸序列：
20.如权利要求19所述的缀合物，其中所述反义结合smn2前体mrna的内含子剪接沉默子n1。
21.如权利要求19所述的缀合物，其中所述反义寡核苷酸包含或由序列5′-tcactttcataatgctgg-3′组成，并且其中所述胸腺嘧啶任选地被尿嘧啶替换。
22.如权利要求19-21中任一项所述的缀合物，其中所述反义寡核苷酸是磷酰二胺吗啉代寡聚体。
23.一种治疗受试者的脊髓性肌萎缩症(sma)的方法，其包括：施用治疗有效量的如权利要求19-22中任一项所述的缀合物。
