本公开内容涉及用于制造病毒载体诸如腺相关病毒(aav)载体的改进的分批(例如，强化灌注)系统和方法，所述系统和方法能够增加临床和商业级aav制造产生率。
背景技术：
1、腺相关病毒(aav)是用于多种人类疾病疗法的基因递送的领先平台；然而，基于aav的疗法的高剂量要求和aav产生中的低分批产量导致了显著高的制造成本并且供应有限无法满足患者需求。尽管aav制造取得了进展，包括可用于悬浮培养的哺乳动物生产者细胞系的开发，但对提高现有的aav制造技术，以实现稳健、高产量、可缩放和具有成本效益的工艺以满足患者供应需求并降低使用基于aav的疗法的治疗的总成本仍然存在显著需求。以单独的分批模式增加细胞密度不足以增加aav体积产量，并且事实上，例如，当使用4倍增加的接种密度用于aav产生时可能导致产量超过100倍减少。因此，需要新的系统和方法来实现更高产量的aav产生以满足临床和治疗需求，以及降低aav疗法开发以及临床和商业制造的成本。
2、本公开内容通过提供降低与现有aav制造平台相关的商品成本的与悬浮培养物中的哺乳动物生产者细胞系相容的成本有效的可缩放aav产生工艺和系统来解决这些需求。
技术实现思路
0、发明概述
1、本公开内容提供了用于在aav生产者细胞培养(例如，aav生产者细胞悬浮培养)中采用灌注进行aav制造的改进的分批(例如，强化灌注)系统和方法。
2、本公开内容提供了使用灌注用于aav产生的改进的分批系统和方法。在一些方面，本公开内容提供了产生重组腺相关病毒(raav)的系统和方法，所述系统和方法包括以下步骤：(a)使用灌注以用新鲜营养物补充培养物和/或去除废弃物产物在生长容器中将aav产生宿主细胞培养至目标细胞密度，其中aav产生宿主细胞包含编码一种或更多种aav组分的遗传物质；(b)在步骤(a)的aav产生宿主细胞中启动一种或更多种辅助病毒功能的表达以启动raav产生；和(c)使用灌注以用新鲜营养物补充培养物和/或去除废弃物产物在产生容器中培养步骤(b)的所述aav产生宿主细胞，从而产生raav。
3、在本文描述的系统和方法的一些实施方案中，aav产生宿主细胞是昆虫细胞或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是hela细胞、cos-7细胞、hek293细胞、a549细胞、bhk细胞、vero细胞、rd细胞或arpe-19细胞。
4、在本文描述的系统和方法的一些实施方案中，aav产生宿主细胞包含aav生产者细胞系(pcl)(例如，哺乳动物或昆虫pcl)，所述aav生产者细胞系(pcl)(例如，哺乳动物或昆虫pcl)包含编码稳定整合到aav产生宿主细胞基因组中的一种或更多种aav组分的遗传物质。在一些实施方案中，aav pcl可以包含降低一种或更多种基因和/或蛋白的表达和/或活性的一种或更多种遗传修饰以降低乳酸和/或氨的产生或积累。
5、在本文描述的系统和方法的一些实施方案中，步骤(a)中的目标细胞密度是至少约1e06个活细胞/ml(vc/ml)。例如，步骤(a)中的目标细胞密度可以在1e06 vc/ml至5e07vc/ml之间。在一些实施方案中，步骤(a)中的目标细胞密度是约1e06 vc/ml、约2e06 vc/ml、约3e06vc/ml、约4e06 vc/ml、约5e06 vc/ml、约6e06 vc/ml、约7e06 vc/ml、约8e06 vc/ml、约9e06 vc/ml、约1e07 vc/ml、约1.1e07 vc/ml、约1.2e07 vc/ml、约1.3e07 vc/ml、约1.4e07vc/ml、约1.5e07 vc/ml、约1.6e07 vc/ml、约1.7e07 vc/ml、约1.8e07 vc/ml、约1.9e07 vc/ml或约2e07 vc/ml。在一些实施方案中，步骤(a)中的目标细胞密度是约3.15e06 vc/ml或约5.0e06 vc/ml。
6、在本文描述的系统和方法的一些实施方案中，产生容器具有1l至12000l之间的体积。例如，产生容器可以具有1l体积、2l体积、5l体积、10l体积、20l体积、50l体积、100l体积、150l体积、200l体积、250l体积、500l体积、1000l体积、1500l体积、2000l体积、2500l体积、3000l体积、3500l体积、4000l体积、4500l体积、5000l体积、5500l体积、6000l体积或12000l体积。
7、在本文描述的系统和方法的一些实施方案中，生长容器和产生容器包括组合的生长/产生容器。
8、在本文描述的系统和方法的一些实施方案中，一种或更多种aav组分包括治疗有效载荷或转基因、一个末端反向重复(itr)或两个itr、由aav rep基因编码的一种或更多种aav复制和/或包装蛋白、和/或由aav cap基因编码的一种或更多种aav结构衣壳蛋白。
9、在本文描述的系统和方法的一些实施方案中，步骤(b)包括用辅助病毒感染步骤(a)的细胞。在一些实施方案中，辅助病毒是腺病毒。在一些实施方案中，辅助病毒是ad5。
10、在本文描述的系统和方法的一些实施方案中，步骤(b)包括在aav产生宿主细胞中诱导由遗传物质编码的一种或更多种辅助病毒功能的表达。
11、在本文描述的系统和方法的一些实施方案中，灌注以约3ml/min/纤维至约15ml/min/纤维的流量进行。例如，灌注可以以约3ml/min/纤维、约4ml/min/纤维、约5ml/min/纤维、约6ml/min/纤维、约7ml/min/纤维、约8ml/min/纤维、约9ml/min/纤维、约10ml/min/纤维、约11ml/min/纤维、约12ml/min/纤维、约13ml/min/纤维、约14ml/min/纤维或约15ml/min/纤维的流量进行。
12、在本文描述的系统和方法的一些实施方案中，灌注以约0.5容器体积/天(vvd)至约10vvd的培养基交换速率进行。例如，灌注可以以约0.5vvd、约1vvd、约1.5vvd、约2vvd、约2.5vvd、约3vvd、约3.5vvd、约4vvd、约4.5vvd、约5vvd、约5.5vvd、约6vvd、约6.5vvd、约7vvd、约7.5vvd、约8vvd、约8.5vvd、约9vvd、约9.5vvd或约10vvd的培养基交换速率进行。在本文描述的系统和方法的一些实施方案中，灌注以小于1vvd的培养基交换速率进行。例如，灌注可以以约0.1vvd、约0.15vvd、约0.2vvd、约0.25vvd、约0.3vvd、约0.35vvd、约0.4vvd、约0.45vvd、约0.5vvd、约0.55vvd、约0.6vvd、约0.65vvd、约0.7vvd、约0.75vvd、约0.8vvd、约0.85vvd、约0.9vvd或约0.95vvd的培养基交换速率进行。在本文描述的系统和方法的一些实施方案中，灌注以约150pl/细胞/天至约2000pl/细胞/天，诸如约150pl/细胞/天至约750pl/细胞/天的细胞比灌注速率(cspr)进行。在一些实施方案中，灌注以大于750pl/细胞/天的cspr进行。
13、在本文描述的系统和方法的一些实施方案中，灌注使用选自以下的灌注系统进行：xcellerex自动灌注系统(aps)(cytiva)；kps tff系统(repligen)；2、4、6、8或10atf单元格式的xcelltm atf系统(repligen)；gea一次性药物分离器系统(gea)；prostaktm微滤模块系统(millipore)；alfa laval cultureonetm系统(alfalaval)；centritech分离系统carrpilot或centritech cell系统(pneumatic scale angelus)；6000s系统(sartorius)；微流体细胞保留装置；scipuretm系统(parker)；声学沉降器(acoustic settler)系统；和edo electro系统(american piezo)。
14、在本文描述的系统和方法的一些实施方案中，步骤(a)包括在生长培养基中培养aav产生宿主细胞；步骤(a)和步骤(c)包括在生长培养基中培养aav产生宿主细胞；步骤(a)包括在产生培养基中培养aav产生宿主细胞；或步骤(a)和步骤(c)包括在产生培养基中培养aav产生宿主细胞。在本文描述的系统和方法的一些实施方案中，步骤(a)包括在生长培养基中培养aav产生宿主细胞，并且步骤(c)包括在产生培养基中培养aav产生宿主细胞。在一些实施方案中，产生培养基在用辅助病毒感染aav产生宿主细胞之后灌注。在一些实施方案中，产生培养基的灌注在用辅助病毒感染细胞之后1小时-6小时(例如，约1小时-2小时、约2小时-3小时、约3小时-4小时、约4小时-5小时或约5小时-6小时)启动。
15、在本文描述的系统和方法的一些实施方案中，步骤(a)和步骤(c)包括在生长培养基和产生培养基的共混物中培养aav产生宿主细胞。例如，生长培养基和产生培养基的共混物可以是生长培养基和产生培养基的10/90、20/80、30/70、40/60、50/50、60/40、70/30、80/20或90/10共混物。
16、在本文描述的系统和方法的一些实施方案中，步骤(a)包括在生长培养基中培养aav产生宿主细胞直到在步骤(b)之前的约24小时，然后过渡为产生培养基。生长培养基可以以约0.5vvd至约1vvd的速率灌注直到在步骤(b)之前的至少约24小时(例如，约96小时、约72小时、约48小时或约24小时)。产生培养基可以在步骤(b)之前的约24小时内(例如，在步骤(b)之前24小时或更少小时，包括在步骤(b)之前至多约1小时和在步骤(b)之前0小时)以约1.5vvd至约2.5vvd的速率灌注。
17、在本文描述的系统和方法的一些实施方案中，培养aav产生宿主细胞在生长阶段培养物和/或产生阶段培养物中进行约48小时和/或约2天至约14天。例如，培养aav产生宿主细胞需要在产生阶段培养约48小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天或约14天的持续时间。
18、灌注可以在约48小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天或约14天的产生阶段持续时间之后停止。
19、本文描述的系统和方法可以允许raav从aav产生宿主细胞释放到产生培养基的上清液中。这样的释放可以在整个产生期是连续的。在一些实施方案中，raav主要在用辅助病毒感染细胞约48小时之后开始释放。也就是说，产生的大部分raav可以在感染约48小时之后释放到上清液中。
20、在一些实施方案中，raav主要在产生培养基中灌注约48小时之后开始释放。也就是说，产生的大部分raav可以在产生培养基中灌注约48小时之后释放到上清液中。在一些实施方案中，停止灌注以将raav保留在上清液中。在一些实施方案中，灌注在感染之后约48小时停止。
21、本文描述的系统和方法的一些实施方案还包括收获raav(例如，在分批模式条件下，诸如在不存在灌注的情况下)和/或下游处理raav。例如，系统和方法还可以包括将根据本文描述的方法产生的raav纯化、澄清和/或浓缩。下游处理可以包括过滤细胞碎片、胶体或聚集体。在一些实施方案中，过滤去除尺寸大于1μm的细胞碎片、胶体或聚集体的颗粒。一些实施方案包括使用阴离子交换(aex)层析纯化raav。
22、在其他方面，本公开内容提供了产生重组腺相关病毒(raav)的方法，包括使用灌注系统培养aav产生宿主细胞，其中aav产生宿主细胞培养物具有1e06 vc/ml至5e07 vc/ml之间的目标细胞密度。
23、在一些实施方案中，aav产生宿主细胞是昆虫细胞或哺乳动物细胞。例如，哺乳动物细胞可以是hela细胞、cos-7细胞、hek293细胞、a549细胞、bhk细胞、vero细胞、rd细胞或arpe-19细胞。
24、在一些实施方案中，aav产生宿主细胞包含aav生产者细胞系(pcl)，所述aav生产者细胞系(pcl)包含编码稳定整合到aav产生宿主细胞基因组中的一种或更多种aav组分的遗传物质。在一些实施方案中，aav pcl可以包含降低一种或更多种基因和/或蛋白的表达和/或活性的一种或更多种遗传修饰以降低乳酸和/或氨的产生或积累。
25、在一些实施方案中，目标细胞密度是约5e06 vc/ml至约5e07 vc/ml。例如，目标细胞密度可以是约1e06 vc/ml、约2e06 vc/ml、约3e06 vc/ml、约4e06 vc/ml、约5e06 vc/ml、约6e06 vc/ml、约7e06 vc/ml、约8e06 vc/ml、约9e06 vc/ml、约1e07 vc/ml、约1.1e07vc/ml、约1.2e07 vc/ml、约1.3e07 vc/ml、约1.4e07 vc/ml、约1.5e07 vc/ml、约1.6e07 vc/ml、约1.7e07 vc/ml、约1.8e07 vc/ml、约1.9e07 vc/ml或约2e07 vc/ml。在某些实施方案中，目标细胞密度是约3.15e06 vc/ml或约5.0e06 vc/ml。
26、在一些实施方案中，方法可以在具有1l至12000l之间的体积的产生容器中进行。例如，产生容器可以具有1l体积、2l体积、5l体积、10l体积、20l体积、50l体积、100l体积、150l体积、200l体积、250l体积、500l体积、1000l体积、1500l体积、2000l体积、2500l体积、3000l体积、3500l体积、4000l体积、4500l体积、5000l体积、5500l体积、6000l体积或12000l体积。
27、在一些实施方案中，方法还包括使用灌注系统在组合的生长/产生容器中使aav产生宿主细胞生长至目标细胞密度。
28、在一些实施方案中，一种或更多种aav组分包括治疗有效载荷或转基因、一个末端反向重复(itr)或两个itr、由aav rep基因编码的一种或更多种aav复制和/或包装蛋白、和/或由aav cap基因编码的一种或更多种aav结构衣壳蛋白。
29、在一些实施方案中，aav产生宿主细胞在适于产生raav的条件下以目标细胞密度培养。适于aav产生的条件可以包括用辅助病毒诸如腺病毒(例如ad5)感染以启动aav产生、用aav产生质粒的三重转染和/或诱导具有产生aav所需组分的稳定整合的诱导型生产者细胞。在一些实施方案中，方法包括在aav产生宿主细胞中启动一种或更多种辅助病毒功能的表达，从而启动raav产生。在一些实施方案中，启动一种或更多种辅助病毒功能的表达包括用辅助病毒感染aav产生宿主细胞。在一些实施方案中，启动一种或更多种辅助病毒功能的表达包括在aav产生宿主细胞中诱导由遗传物质编码的一种或更多种辅助病毒功能的表达。在一些实施方案中，辅助病毒是腺病毒。在一些实施方案中，辅助病毒是ad5。
30、在一些实施方案中，灌注系统以约3ml/min/纤维至约15ml/min/纤维的流量操作。例如，灌注系统可以以约3ml/min/纤维、约4ml/min/纤维、约5ml/min/纤维、约6ml/min/纤维、约7ml/min/纤维、约8ml/min/纤维、约9ml/min/纤维、约10ml/min/纤维、约11ml/min/纤维、约12ml/min/纤维、约13ml/min/纤维、约14ml/min/纤维或约15ml/min/纤维的流量操作。
31、在一些实施方案中，灌注系统以约0.5容器体积/天(vvd)至约10vvd的培养基交换速率操作。例如，灌注系统可以以约0.5vvd、约1vvd、约1.5vvd、约2vvd、约2.5vvd、约3vvd、约3.5vvd、约4vvd、约4.5vvd、约5vvd、约5.5vvd、约6vvd、约6.5vvd、约7vvd、约7.5vvd、约8vvd、约8.5vvd、约9vvd、约9.5vvd或约10vvd的培养基交换速率操作。在本文描述的系统和方法的一些实施方案中，灌注以小于1vvd的培养基交换速率进行。例如，灌注可以以约0.1vvd、约0.15vvd、约0.2vvd、约0.25vvd、约0.3vvd、约0.35vvd、约0.4vvd、约0.45vvd、约0.5vvd、约0.55vvd、约0.6vvd、约0.65vvd、约0.7vvd、约0.75vvd、约0.8vvd、约0.85vvd、约0.9vvd或约0.95vvd的培养基交换速率进行。
32、在本文描述的系统和方法的一些实施方案中，灌注以约150pl/细胞/天至约2000pl/细胞/天，诸如约150pl/细胞/天至约750pl/细胞/天的细胞比灌注速率(cspr)进行。在一些实施方案中，灌注以大于750pl/细胞/天的cspr进行。
33、在一些实施方案中，灌注系统可以是选自以下的一种：xcellerex自动灌注系统(aps)(cytiva)；kps tff系统(repligen)；2、4、6、8或10atf单元格式的xcelltmatf系统(repligen)；gea一次性药物分离器系统(gea)；prostaktm微滤模块系统(millipore)；alfa laval cultureonetm系统(alfa laval)；centritech分离系统carrpilot或centritech cell系统(pneumatic scale angelus)；6000s系统(sartorius)；微流体细胞保留装置；scipuretm系统(parker)；声学沉降器系统；和edo electro系统(american piezo)。
34、在一些实施方案中，aav产生宿主细胞在生长培养基中培养，随后在产生培养基中培养。过渡为产生培养基可以在用辅助病毒感染aav产生宿主细胞之前约0小时至约48小时内或在用辅助病毒感染aav产生宿主细胞之前约24小时发生。生长培养基可以以约0.5vvd至约1vvd的速率灌注，直到用辅助病毒感染aav产生宿主细胞之前约24小时(例如，之前24小时或更少小时，包括之前至多约1小时和之前0小时)。产生培养基可以在用辅助病毒感染aav产生宿主细胞之前的约24小时内开始以约1.5vvd至约2.5vvd的速率灌注。aav产生宿主细胞可以在生长培养基中培养之后并且在产生培养基中培养之前用辅助病毒(例如ad5)感染。在一些实施方案中，产生培养基在用辅助病毒感染细胞之后1小时-6小时(例如，约1小时-2小时、约2小时-3小时、约3小时-4小时、约4小时-5小时或约5小时-6小时)灌注。
35、在一些实施方案中，aav宿主产生细胞在生长培养基和产生培养基的共混物中以目标细胞密度培养。例如，生长培养基和产生培养基的共混物可以是生长培养基和产生培养基的10/90、20/80、30/70、40/60、50/50、60/40、70/30、80/20或90/10共混物。
36、在一些实施方案中，方法包括将aav产生宿主细胞以目标细胞密度培养约48小时和/或约2天至约14天。例如，方法可以包括将所述aav产生宿主细胞以所述目标细胞密度培养持续约48小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天或约14天的持续时间。
37、本文描述的系统和方法可以允许raav从aav产生宿主细胞释放到产生培养基的上清液中。这样的释放可以在整个产生期是连续的。在一些实施方案中，raav主要在用辅助病毒感染细胞约48小时之后开始释放。也就是说，产生的大部分raav可以在用辅助病毒感染约48小时之后释放到上清液中。
38、在一些实施方案中，raav主要在产生培养基中灌注约48小时之后开始释放。也就是说，产生的大部分raav可以在产生培养基中灌注约48小时之后释放到上清液中。在一些实施方案中，停止灌注以将raav保留在上清液中。在一些实施方案中，灌注在约48小时停止。在一些实施方案中，灌注在感染之后约48小时停止。
39、在一些实施方案中，方法还包括收获raav(例如，在分批模式条件下，诸如在不存在灌注的情况下)和/或下游处理raav。例如，下游处理可以包括将raav纯化、澄清和/或浓缩。下游处理可以包括过滤细胞碎片、胶体或聚集体。在一些实施方案中，过滤去除尺寸大于1μm的细胞碎片、胶体或聚集体的颗粒。一些实施方案包括使用阴离子交换(aex)层析纯化raav。
40、在本技术的以下部分中描述了本公开内容的这些和其他方面和特征。
1.一种产生重组腺相关病毒(raav)的方法，包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述aav产生宿主细胞是昆虫细胞或哺乳动物细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述aav产生宿主细胞是哺乳动物细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是hela细胞、cos-7细胞、hek293细胞、a549细胞、bhk细胞、vero细胞、rd细胞或arpe-19细胞。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述aav产生宿主细胞包括aav生产者细胞系(pcl)，所述aav生产者细胞系(pcl)包含编码稳定整合到所述aav产生宿主细胞基因组中的一种或更多种aav组分的遗传物质。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述aav pcl包含降低一种或更多种基因和/或蛋白的表达和/或活性的一种或更多种遗传修饰以降低乳酸和/或氨的产生或积累。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述目标细胞密度是至少约1e06个活细胞/ml(vc/ml)。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述目标细胞密度在1e06vc/ml至5e07 vc/ml之间。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述目标细胞密度是约1e06vc/ml、约2e06 vc/ml、约3e06 vc/ml、约4e06 vc/ml、约5e06 vc/ml、约6e06 vc/ml、约7e06 vc/ml、约8e06 vc/ml、约9e06 vc/ml、约1e07 vc/ml、约1.1e07 vc/ml、约1.2e07vc/ml、约1.3e07 vc/ml、约1.4e07 vc/ml、约1.5e07 vc/ml、约1.6e07 vc/ml、约1.7e07 vc/ml、约1.8e07 vc/ml、约1.9e07 vc/ml或约2e07 vc/ml。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述目标细胞密度是约3.15e06 vc/ml或约5.0e06 vc/ml。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述产生容器具有1l至12000l之间的体积。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述产生容器具有1l体积、2l体积、5l体积、10l体积、20l体积、50l体积、100l体积、150l体积、200l体积、250l体积、500l体积、1000l体积、1500l体积、2000l体积、2500l体积、3000l体积、3500l体积、4000l体积、4500l体积、5000l体积、5500l体积、6000l体积或12000l体积。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述生长容器和所述产生容器是组合的生长/产生容器。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种aav组分包括治疗有效载荷或转基因、一个末端反向重复序列(itr)或两个itr、由aav rep基因编码的一种或更多种aav复制和/或包装蛋白、和/或由aav cap基因编码的一种或更多种aav结构衣壳蛋白。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括用辅助病毒感染步骤(a)的细胞。
16.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括在所述aav产生宿主细胞中诱导由遗传物质编码的一种或更多种辅助病毒功能的表达。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述辅助病毒是腺病毒。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述辅助病毒是ad5。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述灌注以约3ml/min/纤维至约15ml/min/纤维的流量进行。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述灌注以约3ml/min/纤维、约4ml/min/纤维、约5ml/min/纤维、约6ml/min/纤维、约7ml/min/纤维、约8ml/min/纤维、约9ml/min/纤维、约10ml/min/纤维、约11ml/min/纤维、约12ml/min/纤维、约13ml/min/纤维、约14ml/min/纤维或约15ml/min/纤维的流量进行。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述灌注以约0.5容器体积/天(vvd)至约10vvd的培养基交换速率进行。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述灌注以约0.5vvd、约1vvd、约1.5vvd、约2vvd、约2.5vvd、约3vvd、约3.5vvd、约4vvd、约4.5vvd、约5vvd、约5.5vvd、约6vvd、约6.5vvd、约7vvd、约7.5vvd、约8vvd、约8.5vvd、约9vvd、约9.5vvd或约10vvd的培养基交换速率进行。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述灌注以约150pl/细胞/天至约2000pl/细胞/天的细胞比灌注速率(cspr)进行。
24.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述灌注以约150pl/细胞/天至约750pl/细胞/天的cspr进行。
25.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述灌注以大于750pl/细胞/天的cspr进行。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述灌注使用选自以下的灌注系统进行：xcellerex自动灌注系统(aps)(cytiva)；kps tff系统(repligen)；2、4、6、8或10atf单元格式的xcelltm atf系统(repligen)；gea 一次性药物分离器系统(gea)；prostaktm微滤模块系统(millipore)；alfa laval cultureonetm系统(alfalaval)；centritech分离系统carrpilot或centritech cell系统(pneumatic scale angelus)；6000s系统(sartorius)；微流体细胞保留装置；scipuretm系统(parker)；声学沉降器系统；和edo electro系统(americanpiezo)。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括在生长培养基中培养所述aav产生宿主细胞。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中步骤(a)和步骤(c)包括在生长培养基中培养所述aav产生宿主细胞。
29.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括在产生培养基中培养所述aav产生宿主细胞。
30.根据权利要求29所述的方法，其中步骤(a)和步骤(c)包括在产生培养基中培养所述aav产生宿主细胞。
31.根据权利要求15-26中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括在生长培养基中培养所述aav产生宿主细胞，并且步骤(c)包括在产生培养基中培养所述aav产生宿主细胞。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述产生培养基的灌注在用所述辅助病毒感染所述细胞之后约1小时-6小时启动。
33.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中步骤(a)和步骤(c)包括在生长培养基和产生培养基的共混物中培养所述aav产生宿主细胞。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述生长培养基和产生培养基的共混物是生长培养基和产生培养基的10/90、20/80、30/70、40/60、50/50、60/40、70/30、80/20或90/10共混物。
35.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括在生长培养基中培养所述aav产生宿主细胞直到在步骤(b)之前的约24小时，然后过渡为产生培养基。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述生长培养基以约0.5vvd至约1vvd的速率灌注直到在步骤(b)之前的约24小时内。
37.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述产生培养基在步骤(b)之前的约24小时内开始以约1.5vvd至约2.5vvd的速率灌注。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，包括将所述aav产生宿主细胞在生长阶段培养物和/或产生阶段培养物中培养约48小时和/或约2天至约14天。
39.根据权利要求38所述的方法，包括将所述aav产生宿主细胞在产生阶段培养约48小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天或约14天的持续时间。
40.根据权利要求38或39所述的方法，还包括在约48小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天或约14天的产生阶段持续时间之后停止灌注。
41.根据权利要求38-40中任一项所述的方法，其中所述raav从所述aav产生宿主细胞释放到所述产生培养基的上清液中。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述raav主要在用所述辅助病毒感染所述细胞约48小时之后开始释放。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述灌注在感染之后约48小时停止。
44.根据权利要求43所述的方法，还包括收获所述raav。
45.根据权利要求44所述的方法，其中收获所述raav在分批模式条件下进行。
46.根据权利要求1-45中任一项所述的方法，还包括所述raav的下游处理。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述下游处理包括将所述raav纯化、澄清和/或浓缩。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述下游处理包括过滤细胞碎片、胶体或聚集体。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述过滤去除尺寸大于1μm的细胞碎片、胶体或聚集体的颗粒。
50.根据权利要求46-49中任一项所述的方法，包括使用阴离子交换(aex)层析纯化所述raav。
51.一种产生重组腺相关病毒(raav)的方法，包括使用灌注系统培养aav产生宿主细胞，其中所述aav产生宿主细胞培养物具有1e06 vc/ml至5e07 vc/ml之间的目标细胞密度。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述aav产生宿主细胞是昆虫细胞或哺乳动物细胞。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述aav产生宿主细胞是哺乳动物细胞。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是hela细胞、cos-7细胞、hek293细胞、a549细胞、bhk细胞、vero细胞、rd细胞或arpe-19细胞。
55.根据权利要求51-54中任一项所述的方法，其中所述aav产生宿主细胞包括aav生产者细胞系(pcl)，所述aav生产者细胞系(pcl)包含编码稳定整合到所述aav产生宿主细胞基因组中的一种或更多种aav组分的遗传物质。
56.根据权利要求51-55中任一项所述的方法，其中所述aav pcl包含降低一种或更多种基因和/或蛋白的表达和/或活性的一种或更多种遗传修饰以降低乳酸和/或氨的产生或积累。
57.根据权利要求51-56中任一项所述的方法，其中所述目标细胞密度是约5e06 vc/ml至约5e07 vc/ml。
58.根据权利要求51-57中任一项所述的方法，其中所述目标细胞密度是约1e06、约2e06、约3e06、约4e06、约5e06、约6e06、约7e06、约8e06、约9e06、约1e07、约1.1e07、约1.2e07、约1.3e07、约1.4e07、约1.5e07、约1.6e07、约1.7e07、约1.8e07、约1.9e07或约2e07vc/ml。
59.根据权利要求51-58中任一项所述的方法，其中所述目标细胞密度是约3.15e06vc/ml或约5.0e06 vc/ml。
60.根据权利要求51-59中任一项所述的方法，其中所述方法在具有1l至12000l之间的体积的产生容器中进行。
61.根据权利要求51-60中任一项所述的方法，其中所述方法在具有1l体积、2l体积、5l体积、10l体积、20l体积、50l体积、100l体积、150l体积、200l体积、250l体积、500l体积、1000l体积、1500l体积、2000l体积、2500l体积、3000l体积、3500l体积、4000l体积、4500l体积、5000l体积、5500l体积、6000l体积或12000l体积的产生容器中进行。
62.根据权利要求51-61中任一项所述的方法，还包括使用所述灌注系统在组合的生长/产生容器中使所述aav产生宿主细胞生长至所述目标细胞密度。
63.根据权利要求51-62中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种aav组分包括治疗有效载荷或转基因、一个末端反向重复序列(itr)或两个itr、由aav rep基因编码的一种或更多种aav复制和/或包装蛋白、和/或由aav cap基因编码的一种或更多种aav结构衣壳蛋白。
64.根据权利要求51-63中任一项所述的方法，还包括在所述aav产生宿主细胞中启动一种或更多种辅助病毒功能的表达，从而启动raav产生。
65.根据权利要求64所述的方法，其中启动一种或更多种辅助病毒功能的表达包括用辅助病毒感染所述aav产生宿主细胞。
66.根据权利要求64所述的方法，其中启动一种或更多种辅助病毒功能的表达包括在所述aav产生宿主细胞中诱导由遗传物质编码的一种或更多种辅助病毒功能的表达。
67.根据权利要求65所述的方法，其中所述辅助病毒是腺病毒。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述辅助病毒是ad5。
69.根据权利要求51-68中任一项所述的方法，其中所述aav产生宿主细胞在适于产生raav的条件下以所述目标细胞密度培养。
70.根据权利要求51-68中任一项所述的方法，其中所述灌注系统以约3ml/min/纤维至约15ml/min/纤维的流量操作。
71.根据权利要求51-70中任一项所述的方法，其中所述灌注系统以约3ml/min/纤维、约4ml/min/纤维、约5ml/min/纤维、约6ml/min/纤维、约7ml/min/纤维、约8ml/min/纤维、约9ml/min/纤维、约10ml/min/纤维、约11ml/min/纤维、约12ml/min/纤维、约13ml/min/纤维、约14ml/min/纤维或约15ml/min/纤维的流量操作。
72.根据权利要求51-71中任一项所述的方法，其中所述灌注系统以约0.5容器体积/天(vvd)至约10vvd的培养基交换速率操作。
73.根据权利要求51-72中任一项所述的方法，其中所述灌注系统以约0.5vvd、约1vvd、约1.5vvd、约2vvd、约2.5vvd、约3vvd、约3.5vvd、约4vvd、约4.5vvd、约5vvd、约5.5vvd、约6vvd、约6.5vvd、约7vvd、约7.5vvd、约8vvd、约8.5vvd、约9vvd、约9.5vvd或约10vvd的培养基交换速率操作。
74.根据权利要求51-73中任一项所述的方法，其中所述灌注以约150pl/细胞/天至约2000pl/细胞/天的细胞比灌注速率(cspr)进行。
75.根据权利要求51-73中任一项所述的方法，其中所述灌注以约150pl/细胞/天至约750pl/细胞/天的cspr进行。
76.根据权利要求51-73中任一项所述的方法，其中所述灌注以大于750pl/细胞/天的cspr进行。
77.根据权利要求51-76中任一项所述的方法，其中所述灌注系统选自：xcellerex自动灌注系统(aps)(cytiva)；kps tff系统(repligen)；2、4、6、8或10atf单元格式的xcelltm atf系统(repligen)；gea一次性药物分离器系统(gea)；prostaktm微滤模块系统(millipore)；alfa laval cultureonetm系统(alfa laval)；centritech分离系统carrpilot或centritech cell系统(pneumatic scale angelus)；6000s系统(sartorius)；微流体细胞保留装置；scipuretm系统(parker)；声学沉降器系统；和edo electro系统(american piezo)。
78.根据权利要求51-77中任一项所述的方法，其中所述aav产生宿主细胞在生长培养基中培养，随后在产生培养基中培养。
79.根据权利要求78所述的方法，其中过渡为所述产生培养基发生在用所述辅助病毒感染所述aav产生宿主细胞之前约24小时。
80.根据权利要求78或79所述的方法，其中所述生长培养基以约0.5vvd至约1vvd的速率灌注直到用所述辅助病毒感染所述aav产生宿主细胞之前的约24小时内。
81.根据权利要求78-80中任一项所述的方法，其中所述产生培养基在用所述辅助病毒感染所述aav产生宿主细胞之前的约24小时内开始以约1.5vvd至约2.5vvd的速率灌注。
82.根据权利要求78所述的方法，其中将所述aav产生宿主细胞在所述生长培养基中培养之后并且在所述产生培养基中培养之前用辅助病毒感染，其中所述产生培养基在用所述辅助病毒感染所述细胞之后1小时至6小时灌注。
83.根据权利要求51-77中任一项所述的方法，其中所述aav宿主产生细胞在生长培养基和产生培养基的共混物中以所述目标细胞密度培养。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述生长培养基和产生培养基的共混物是生长培养基和产生培养基的10/90、20/80、30/70、40/60、50/50、60/40、70/30、80/20或90/10共混物。
85.根据权利要求51-84中任一项所述的方法，包括将所述aav产生宿主细胞以所述目标细胞密度培养约48小时和/或约2天至约14天。
86.根据权利要求85所述的方法，包括将所述aav产生宿主细胞以所述目标细胞密度培养持续约48小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天或约14天的持续时间。
87.根据权利要求85或86所述的方法，其中所述raav从所述aav产生宿主细胞释放到所述产生培养基的上清液中。
88.根据权利要求82所述的方法，其中所述raav主要在用所述辅助病毒感染所述细胞约48小时之后开始释放。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述灌注在感染之后约48小时停止。
90.根据权利要求51-89中任一项所述的方法，还包括收获所述raav。
91.根据权利要求90所述的方法，其中收获所述raav在分批模式条件下进行。
92.根据权利要求51-91中任一项所述的方法，还包括所述raav的下游处理。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述下游处理包括将所述raav纯化、澄清和/或浓缩。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述下游处理包括过滤细胞碎片、胶体或聚集体。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述过滤去除尺寸大于1μm的细胞碎片、胶体或聚集体的颗粒。
96.根据权利要求93-95中任一项所述的方法，包括使用阴离子交换(aex)层析纯化所述raav。
