本发明涉及细胞生物学领域，具体地涉及一种针对ipsc-nk细胞的嵌合抗原受体及其应用。
背景技术：
1、嵌合抗原受体(car)是通过对细胞进行基因修饰，来产生肿瘤靶标特异性免疫细胞的常用方法。car已被引入不同类型的免疫细胞，包括t细胞，nk细胞和巨噬细胞，这些car转导的免疫细胞分别被命名为car-t，car-nk和car-m。
2、为了提高对肿瘤的特异性杀伤，将car分子表达于nk上是一种有效的改造方案，然而由于nk细胞的特性，它们对于通过逆转录病毒载体转导的传统方式有天然的抵抗性，导致转导效率十分低下。除了直接转导至nk细胞外，还可以将car基因通过crispr/cas9的手段编辑到ipsc基因组中，再将编辑正确的car-ipsc分化成car-ink细胞。
3、但能应用于上述技术路径的car分子结构需要满足诸多条件，包括：(1)该car分子能在ipsc阶段获得稳定表达，以便完成编辑正确的ipsc克隆的筛选；(2)该car分子的表达不会影响到从ipsc到ink细胞的分化和扩增过程，以及ink细胞的本身固有的天然免疫能力；(3)该car结构在ink阶段能够维持足够的表达水平并具有良好的抗原识别与杀伤功能；(4)该car分子结构能够与多种不同的scfv适配。目前，本领域缺乏能同时满足以上条件的car结构。
4、因此，本领域迫切需要开发适用于ipsc以及ipsc来源的ink细胞的car结构。
技术实现思路
1、本发明的目的就是提供适用于ipsc以及ipsc来源的ink细胞的car结构。
2、在本发明的第一方面，提供了一种工程化ipsc细胞，所述工程化ipsc细胞中导入有一外源表达载体，所述外源表达载体包含嵌合抗原受体(car)的编码基因；
3、所述car含有如式i所示的结构：
4、l-eb-h-tm-icd1-icd2(i)
5、式中，
6、各“-”独立地为连接肽或肽键；
7、l为无或信号肽序列；
8、eb为胞外结合域；
9、h为铰链区；
10、tm为来自2b4蛋白的跨膜区；
11、icd1来自2b4蛋白的胞内区；
12、icd2是源于cd3ζ的胞浆信号传导序列。
13、在另一优选例中，所述l为选自下组蛋白的信号肽：csf2rb、cd8、gm-csf、cd4、cd28、cd137、nkg2d，或其突变/修饰体，或其组合。
14、在另一优选例中，所述l的序列如seq id no:1所示。
15、在另一优选例中，所述eb为靶向一种或多种靶蛋白的scfv。
16、在另一优选例中，所述靶蛋白包括：cd19、bcma、cd22、cd20、egfr、her2、l1cam、mesothelin、gd2、cd171、epcam、cea、psma、gpc3、ror1、fap、cd33、cd38、cd123、cd138、cd30、cd70、nectin-4、msln、ncam1、ceacam5、nkg2d、mica/b、kirs、或其组合。
17、在另一优选例中，所述靶蛋白包括：cd19、bcma、或其组合。
18、在另一优选例中，所述靶向cd19的scfv的序列如seq id no:2所示。
19、在另一优选例中，所述靶向bcma的scfv的序列如seq id no:20所示。
20、在另一优选例中，所述eb同时靶向cd19和bcma。
21、在另一优选例中，所述h为选自下组蛋白的铰链区：cd8、cd28、cd137、igg、或其组合。
22、在另一优选例中，所述h为来源于cd8或cd28蛋白的铰链区。
23、在另一优选例中，所述h为来源于cd8的铰链区，具有如seq id no:4所示的氨基酸序列。
24、在另一优选例中，所述h为来源于cd28的铰链区，具有如seq id no:3所示的氨基酸序列。
25、在另一优选例中，所述tm为2b4蛋白的跨膜区，具有如seq id no:6所示的氨基酸序列。
26、在另一优选例中，所述icd1为2b4蛋白的胞内全长序列，具有如seq id no:10所示的氨基酸序列。
27、在另一优选例中，所述icd2具有如seq id no:13所示的氨基酸序列。
28、在另一优选例中，所述car具有如seq id no:15或seq id no:22所示的氨基酸序列。
29、在另一优选例中，所述外源表达载体选自下组：质粒、病毒载体、转座子、或其组合。
30、在另一优选例中，所述载体为质粒。
31、在另一优选例中，所述导入包括：基因编辑导入、电转、病毒转导、或其组合。
32、在另一优选例中，所述基因编辑导入是采用crispr/cas9系统进行基因编辑。
33、在另一优选例中，所述导入包括步骤：采用crispr/cas9系统将所述car编码基因敲入aavs1位点。
34、在另一优选例中，用流式细胞术检测工程化ipsc细胞上的car表达水平，其平均荧光强度(mfi)值记为r1，r1≥2000，优选地r1≥2500，更优选地r1≥3000。
35、在另一优选例中，对照工程化ipsc细胞表达如seq id no:14所示的car，用流式细胞术检测对照工程化ipsc细胞上的car表达水平，其平均荧光强度(mfi)值记为r0，r1/r0≥5，优选地r1/r0≥10，更优选地r1/r0≥15。
36、在本发明的第二方面，提供了一种制备car-nk细胞的方法，包括步骤：对本发明第一方面所述的工程化ipsc细胞进行分化培养，获得car-nk细胞。
37、在另一优选例中，所述分化培养包括步骤：
38、a.在反应容器中对所述car-ipsc进行扩增培养，得到car-ipsc细胞团块；
39、b.在所述反应容器中加入细胞因子组合，对所述car-ipsc细胞团块进行诱导分化培养，获得所述car-nk细胞。
40、在另一优选例中，所述扩增培养7-14天。
41、在另一优选例中，所述诱导分化培养26-30天，例如28天。
42、在另一优选例中，所述反应容器为生物反应器。
43、在本发明的第三方面，提供了一种car-nk细胞，所述car-nk细胞由本发明第一方面所述的工程化ipsc细胞分化获得，或由本发明第二方面所述的方法制备。
44、在本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：
45、(a)如本发明第三方面所述的car-nk细胞；和
46、(b)药学上可接受的载体。
47、在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：注射剂、冻干剂。
48、在另一优选例中，所述药物组合物包括0.01～99.99％的如本发明第一方面所述的工程化细胞；和0.01～99.99％的药学上可接受的载体；所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
49、在另一优选例中，所述药物组合物中所述car-nk细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/ml，较佳地1×104-1×107个细胞/ml。
50、在本发明的第五方面，提供了一种如本发明第三方面所述的car-nk细胞或如本发明第四方面所述的药物组合物的用途，用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物或制剂。
51、在另一优选例中，所述肿瘤为cd19和/或bcma阳性肿瘤。
52、在另一优选例中，所述肿瘤包括：实体瘤、血液瘤、或其组合。
53、在本发明的第六方面，提供了一种治疗肿瘤或癌症的方法，所述方法包括：向有需要的受试者施用如本发明第三方面所述的car-nk细胞或如本发明第四方面所述的药物组合物。
54、在另一优选例中，所述有需要的受试者为肿瘤患者。
55、在另一优选例中，所述肿瘤包括：实体瘤、血液瘤、或其组合。
56、在另一优选例中，所述受试者包括非人哺乳动物、或人。
57、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
1.一种工程化ipsc细胞，其特征在于，所述工程化ipsc细胞中导入有一外源表达载体，所述外源表达载体包含嵌合抗原受体(car)的编码基因；
2.如权利要求1所述的工程化ipsc细胞，其特征在于，所述eb为靶向一种或多种靶蛋白的scfv，所述靶蛋白包括：cd19、bcma、或其组合。
3.如权利要求1所述的工程化ipsc细胞，其特征在于，所述h为来源于cd8的铰链区。
4.如权利要求1所述的工程化ipsc细胞，其特征在于，所述car具有如seq id no:15、20或23任一项所示的氨基酸序列。
5.如权利要求1所述的工程化ipsc细胞，其特征在于，所述导入包括步骤：采用crispr/cas9系统将所述car编码基因敲入aavs1位点。
6.如权利要求1所述的工程化ipsc细胞，其特征在于，用流式细胞术检测所述工程化ipsc细胞上的car表达水平，其平均荧光强度(mfi)值记为r1，r1≥2000。
7.一种制备car-nk细胞的方法，其特征在于，包括步骤：对权利要求1所述的工程化ipsc细胞进行分化培养，获得car-nk细胞。
8.一种car-nk细胞，其特征在于，所述car-nk细胞由权利要求1所述的工程化ipsc细胞分化获得，或由权利要求7所述的方法制备。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：
10.一种如权利要求8所述的car-nk细胞或如权利要求9所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物或制剂。
