本发明涉及疫苗制备，具体涉及一种禽致病性大肠杆菌菌影疫苗及其应用。
背景技术：
1、鸭源鸡杆菌(gallibacterium anatis,g.anatis)是鸡杆菌属的代表种作为一种常在菌，常定植在家禽的上呼吸道和下生殖道，该菌的感染会造成输卵管囊肿、输卵管炎、败血症、卵巢炎和腹膜炎，尤其在某些免疫抑制、各种应激源的情况下，更容易引发呼吸系统、生殖系统和全身性疾病，且鸭源鸡杆菌通常会加剧其他病原微生物的感染和疾病的发生，临床上常与鸡传染性支气管炎、大肠杆菌和支原体等混合感染，不仅可引起蛋鸡输卵管炎及输卵管囊肿等疾病，还严重危害养殖经济效益。
2、目前，国内外的分离菌株均存在多重耐药性问题，导致现有的疫苗药物防制效果差，与其他病原混合感染现象多发。因此，亟需开发一种高效预防鸭源鸡杆菌感染引发疾病的疫苗。
技术实现思路
1、为提供一种预防鸭源鸡杆菌感染引发疾病的产品，本发明提供了一种禽致病性大肠杆菌菌影疫苗及其应用，本发明制备的禽致病性大肠杆菌菌影疫苗能有效的预防和治疗鸭源鸡杆菌感染，攻毒后，菌影疫苗免疫鸡后组织器官中的细菌拷贝数显著低于利用单质粒pcaggs-flfa和菌影免疫后的细菌拷贝数，菌影疫苗免疫后抗体水平显著高于单质粒pcaggs-flfa和菌影单独免疫组。
2、本发明提供了一种菌影疫苗，所述菌影疫苗是将pcaggs-flfa质粒装载入禽致病性大肠杆菌菌影所得；
3、所述pcaggs-flfa质粒，是由flfa基因连接在pgaggs载体的ecori和kpni酶切位点获得；
4、所述禽致病性大肠杆菌菌影制备过程为：将噬菌体裂解基因e和金黄色葡萄球菌核酸酶a合成基因e-sn，然后连接在载体上，转化大肠杆菌筛选获得重组质粒，然后将重组质粒转入对氨苄青霉素敏感的禽致病性大肠杆菌感受态细胞中，获得大肠杆菌重组菌，扩大培养后诱导蛋白e-sn共表达，离心收集菌体后洗涤，然后重悬、冻干，获得禽致病性大肠杆菌菌影。
5、本发明以临床分离的鸭源鸡杆菌分离株的菌毛基因flfa为研究对象构建重组表达质粒pcaggs-flfa，同时将噬菌体裂解基因e与金黄色葡萄球菌核酸酶a，简称sn，共同克隆在温度敏感型λpl/pr-ci857表达系统中，构建e基因与金黄色葡萄球菌核酸酶a共表达的温度敏感调控重组质粒pbv-e-sn，随后将上述温控重组质粒转化大肠杆菌分离株制备菌影，最后将携带flfa基因的重组表达质粒pcaggs-flfa装载入菌影获得菌影疫苗。本发明制备的禽致病性大肠杆菌菌影疫苗能有效的预防鸭源鸡杆菌感染。
6、进一步地，所述的pcaggs-flfa质粒装载入禽致病性大肠杆菌菌影的过程为：将菌影重悬于含pcaggs-flfa质粒的pbs缓冲液中，所述菌影和pbs缓冲液的用量比为：106cfu～1010cfu：100μl～120μl；
7、所述pbs缓冲液中pcaggs-flfa质粒浓度为0.4mg/ml～1mg/ml。
8、进一步地，所述基因e-sn连接在pbv220载体上。
9、进一步地，重组质粒通过电转化方式转入对氨苄青霉素敏感的禽致病性大肠杆菌感受态细胞。
10、进一步地，扩大培养过程为：将大肠杆菌重组菌在含有氨苄青霉素的lb液体培养基中于28℃～30℃，200rpm～220rpm下培养至od600为0.4～0.5。
11、进一步地，诱导蛋白e-sn共表达过程为：将温度迅速升高至42℃以诱导蛋白e-sn共表达。
12、进一步地，所述离心条件为7000rpm～8000rpm离心10min～15min。
13、进一步地，冻干前先将pbs重悬的菌体置于-20℃预冻12h后-80℃预冻4h。
14、进一步地，所述pcaggs-flfa质粒的制备过程为：扩增得到长度为597bp的flfa基因，然后与pmd18-t载体连接获得pmd18t-flfa重组质粒；用限制性内切酶kpni和ecori将flfa基因从重组质粒pmd18t-flfa上切下获得flfa基因片段，pgaggs载体用限制性内切酶kpni和ecori进行酶切获得pcaggs载体片段；然后用t4 dna连接酶连接flfa基因片段和获得pcaggs载体片段获得pcaggs-flfa重组表达质粒，简称pcaggs-flfa质粒。
15、本发明还提供了所述菌影疫苗在制备预防鸭源鸡杆菌感染疾病引发产品中的应用，所述产品为以所述的菌影疫苗为唯一有效成分的疫苗制剂。
16、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
17、1、本发明制备的禽致病性大肠杆菌影疫苗能有效的预防鸭源鸡杆菌感染。攻毒后，菌影疫苗免疫鸡后组织器官中的细菌拷贝数显著低于利用单质粒pcaggs-flfa和菌影免疫后的细菌拷贝数，菌影疫苗免疫后抗体水平显著高于单质粒pcaggs-flfa和菌影单独免疫组。本发明制备获得的菌影作为装载载体，提高了免疫效果。
18、2、本发明获得的禽致病性大肠杆菌菌影疫苗的免疫效果良好、制备工艺简单、可塑性好、生产成本低、递送方式简单、生产周期相对较短、方便储存和运输。
19、3、本发明以临床分离的鸭源鸡杆菌分离株的菌毛基因flfa为研究对象构建重组表达质粒pcaggs-flfa，同时将噬菌体裂解基因e与金黄色葡萄球菌核酸酶a，简称sn，共同克隆在温度敏感型λpl/pr-ci857表达系统中，构建e基因与金黄色葡萄球菌核酸酶sn共表达的温度敏感调控重组质粒pbv-e-sn，随后将上述温控重组质粒转化大肠杆菌分离株制备菌影，最后将携带flfa基因的重组表达质粒pcaggs-flfa装载入菌影获得菌影疫苗，该菌影疫苗为核酸疫苗的应用提供了依据。
1.一种菌影疫苗，其特征在于，所述菌影疫苗是将pcaggs-flfa质粒装载入禽致病性大肠杆菌菌影所得；
2.根据权利要求1所述的菌影疫苗，其特征在于，所述的pcaggs-flfa质粒装载入禽致病性大肠杆菌菌影的过程为：将菌影重悬于含pcaggs-flfa质粒的pbs缓冲液中，所述菌影和pbs缓冲液的用量比为：106cfu～1010cfu：100μl～120μl；
3.根据权利要求1所述的菌影疫苗，其特征在于，所述基因e-sn连接在pbv220载体上。
4.根据权利要求1所述的菌影疫苗，其特征在于，重组质粒通过电转化方式转入对氨苄青霉素敏感的禽致病性大肠杆菌感受态细胞。
5.根据权利要求1所述的菌影疫苗，其特征在于，扩大培养过程为：将大肠杆菌重组菌在含有氨苄青霉素的lb液体培养基中于28℃～30℃，200rpm～220rpm下培养至od600为0.4～0.5。
6.根据权利要求1所述的菌影疫苗，其特征在于，诱导蛋白e-sn共表达过程为：将温度迅速升高至42℃以诱导蛋白e-sn共表达。
7.根据权利要求1所述的菌影疫苗，其特征在于，所述离心条件为7000rpm～8000rpm离心10min～15min。
8.根据权利要求1所述的菌影疫苗，其特征在于，冻干前先将pbs重悬的菌体置于-20℃预冻12h后-80℃预冻4h。
9.根据权利要求1所述的菌影疫苗，其特征在于，所述pcaggs-flfa质粒的制备过程为：扩增得到长度为597bp的flfa基因，然后与pmd18-t载体连接获得pmd18t-flfa重组质粒；用限制性内切酶kpni和ecori将flfa基因从重组质粒pmd18t-flfa上切下获得flfa基因片段，pgaggs载体用限制性内切酶kpni和ecori进行酶切获得pcaggs载体片段；然后用t4 dna连接酶连接flfa基因片段和获得pcaggs载体片段获得pcaggs-flfa重组表达质粒，简称pcaggs-flfa质粒。
10.一种权利要求1-9任一项所述的菌影疫苗在制备预防鸭源鸡杆菌感染引发疾病产品中的应用，其特征在于，所述产品为以所述的菌影疫苗为唯一有效成分的疫苗制剂。
