本发明属于基因工程，涉及植物基因工程技术，尤其涉及花生抗咪唑乙烟酸基因序列及其在植物转基因上的应用。
背景技术：
1、花生作为我国重要的油料作物和经济作物，与其他油料作物相比，花生总产量大、单产水平高、单位面积产油量高、单位面积种植效益高，具有较大竞争优势，在保障食用油安全供给中发挥着不可替代的作用。近年来，花生作为遗传转化技术主要的研究对象，受到各国科学家的广泛关注，应用转基因技术已获得多个重要农艺性状的改良，如抗除草剂、高油酸品质等。
2、在遗传转化过程中，将便于筛选的标记基因或报告基因插入表达载体，筛选标记基因或报告基因与目的基因共同整合到宿主植物细胞染色体基因组中，以便于筛选转化成功的转基因阳性细胞。因此，发展安全高效且易于操作的筛选标记基因成为基因工程研究的热点之一。
3、目前，植物遗传转化中广泛应用的筛选标记基因主要有抗生素抗性基因和抗除草剂基因。抗生素抗性酶基因有新霉素磷酸转移酶(neomycinphosphotransferase、nptⅱ)、潮霉素磷酸转移酶基因(hygromycinphosphotransferase、hpt)等。其中，潮霉素因高效和低假阳性常被用于多个物种，如植物、酵母、真菌、动物等的遗传转化当中。此外，抗除草剂基因作为转基因筛选标记基因的主要有bxn(bromoxynil-specificnitrilase，3,5-二溴-4-羟基-1-氰基苯，专一性降解溴苯腈的腈水解酶)基因、bar基因(bialaphos resistance，产生草丁膦乙酰转移酶，抗草丁膦或草铵膦)等，这些筛选标记基因或报告基因来源于细菌或真菌，遗传转化后的转基因植物会携带筛选标记基因。这种从微生物到植物或作物的抗性基因跨界转移，引起了公众对转基因食品食用安全的担忧，因此存在转基因安全性评价等技术和政策限制。
4、近年来，通过改造植物或者作物自身的抗性基因，采用作物内源的抗性基因作为转基因阳性检测的筛选标记基因进行转基因作物研究受到越来越多的重视。
5、乙酰乳酸合成酶als(acetolactate synthase)是植物体内支链氨基酸(亮氨酸leu、异亮氨酸ile、缬氨酸val)生物合成途径的关键酶，也是乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂在植物体内的作用靶点。als抑制剂类除草剂通过抑制als酶的活性，导致val、leu和ile等支链氨基酸的合成受阻，体内蛋白质合成出现异常，最终导致植物代谢紊乱，生长停滞，继而死亡。国内外系列研究中，通过als基因定点突变，使其编码酶的除草剂识别和结合位点的关键氨基酸残基发生突变，导致als对除草剂敏感性下降，进而使植物产生对als类除草剂的抗性。
6、由于als催化支链氨基酸的合成生物途径只存在于植物、微生物中，人和动物体内缺乏此代谢途径，所以als抑制剂类除草剂对人畜相对安全，是理想的用于杀灭杂草的除草剂。例如，咪唑咪酮类除草剂是als抑制剂类除草剂的一大类，其价格相对较低，且具有其他除草剂不具有的独特优势，如高效、杀草谱广、高选择性和对人畜高度安全等优点。基于此，利用抗咪唑啉酮类除草剂的花生内源的als基因作为转基因筛选标记或报告基因，可以避免细菌等来源的异源基因转化带来的转基因安全风险，而且对人畜相对安全，可以成为新的筛选标记基因。
技术实现思路
1、本发明的目的为了实现花生内源的als基因的定点突变，将花生乙酰乳酸合成酶(als)基因作为筛选标记基因在培育转基因植物中的应用，该应用能够以抗咪唑啉酮类除草剂花生als基因作为转基因筛选标记基因，从而扩展转基因筛选标记的范围，并且因所筛选的基因属于植物内源基因，进而获得稳定、高效且对人畜更加安全的转基因筛选标记或报告基因。
2、本发明采用的技术方案提供了花生抗咪唑乙烟酸基因序列，关键在于，花生乙酰乳酸合成酶编码基因的碱基序列如seq id no1所示，命名为ahals基因，上述的花生抗咪唑乙烟酸基因序列为如seq id no3所示的花生乙酰乳酸合成酶突变基因，命名为ahals-376突变基因，上述的ahals-376突变基因由2001个碱基组成；上述ahals基因编码的乙酰乳酸合成酶的蛋白序列如seq id no2所示，命名为als蛋白质序列，上述的ahals-376突变基因编码蛋白序列如seq id no4所示的突变型乙酰乳酸合成酶。
3、具体的，上述的ahals-376突变基因由花生乙酰乳酸合成酶编码基因定点突变而来，上述的定点突变是指在所述的ahals基因序列的编码区第1113位碱基引入突变位点，使t突变成a；上述突变型乙酰乳酸合成酶的蛋白序列由上述的als蛋白质序列的第376位氨基酸由asp突变为glu得来。
4、具体的，上述的定点突变是指对花生内源ahals基因序列进行pcr介导的定点突变，得到上述的ahals-376突变基因。
5、进一步的，在上述的pcr介导的定点突变之前，先要进行ahals基因的克隆，具体操作为：
6、s1、通过查询基因数据库，确定花生的ahals基因序列；
7、s2、设计基因特异引物；
8、s3、采用ctab法提取花生叶片基因组dna，pcr克隆ahals基因序列并对获得的ahals序列进行测序鉴定。
9、优选的，上述的pcr介导的定点突变指通过3次pcr介导实现定向突变，获得ahals-376突变基因，第一次pcr反应引物为：
10、ahals-f：5’-atggctgccactgcttcca-3’和
11、ahals_t1113a-r：5’-acacgttcatcaaatctcacccca-3’；
12、第二次pcr反应引物为：
13、ahals_t1113a-f：5’-tgtgacgggaaagcttgagg-3’和
14、ahals-r：5’-tcaatattttgttctgccatcgcct-3’；
15、第三次pcr反应引物为所述的引物ahals-f和所述的引物ahals-r；
16、上述的三次pcr的程序为：97℃～99℃变形28s～32s，97℃～99℃预变性8s～12s，58℃～62℃扩增4s～6s，70℃～74℃延伸8s～12s，共32～38个循环，70℃～74℃终延伸0.8min～1.2min。
17、更具体的，上述的s2步骤中的基因特异引物为上述的引物ahals-f和所述的引物ahals-r；
18、上述的s3步骤的pcr程序为：97℃～99℃变形28s～32s，97℃～99℃预变性8s～12s，58℃～62℃扩增4s～6s，70℃～74℃延伸8s～12s，共32～38个循环，70℃～74℃终延伸0.8min～1.2min。
19、花生抗咪唑乙烟酸基因序列在植物转基因上的应用，上述的花生抗咪唑乙烟酸基因序列上述的基因序列，关键在于，将上述的ahals-376突变基因作为筛选标记基因在转基因植物上的应用。
20、进一步的，将ahals-376突变基因导入到转基因植株中，经咪唑啉酮类除草剂筛选得到转基因植株。
21、具体的，将ahals-376突变基因导入到拟南芥中指将ahals-376突变基因作为抗咪唑啉酮类除草剂的筛选标记基因插入到植物表达载体中，构建重组表达载体，然后将上述的重组表达载体通过农杆菌介导的方法转化到拟南芥植株中；上述的拟南芥植株在含有草铵膦和咪唑乙烟酸的筛选培养基上进行筛选，上述的草铵膦筛选浓度为9mg/l，咪唑乙烟酸浓度为1mg/l。
22、更具体的，上述构建重组表达载体具体方法为：将ahals基因和ahals-376突变基因克隆到pcambia3301植物表达载体上，利用组成型表达的camv 35s启动子驱动ahals基因和ahals-376突变基因，构建包含ahals基因和ahals-376突变基因的重组质粒表达载体，用电击法分别将上述的重组质粒表达载体转化农杆菌gv3101菌株，得到重组菌株，提取质粒进行pcr和酶切鉴定，分别获得内源基因ahals基因和带有抗性基因ahals-376突变基因的植物表达载体重组菌株；
23、上述构建重组表达载体具体方法中设计的基因特异性引物为：
24、ahals-t1113asacf：5’-gcgagctcatggctgccactgcttcca-3’和ahals-t1113asmar：5’-tcccccgggtcaatattttgttctgccatcgcct-3’。
25、本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
26、本发明通过定点突变获得序列为seq id no3所示的ahals-376突变基因，在ahals基因编码区的第1113位碱基引入突变位点(以起始密码子atg计为第1位)，使1个碱基发生突变，即t突变成a，ahals-376突变基因的其余核苷酸序列与花生内源ahals基因的核苷酸序列无差异。该突变仅导致蛋白序列第376位asp变为glu，即seq id no4除asp376glu位点外与序列seq id no2无差异，其他位点未发生突变。
27、本发明将获得的ahals-376突变基因作为筛选标记基因在培育转基因拟南芥及其他转基因植物植株中的应用，首次实现了花生乙酰乳酸合成酶基因在拟南芥等植物遗传转化中的筛选应用。本发明将花生的ahals-376作为筛选标记基因，相较于其他筛选标记基因，本发明的筛选标记基因来源植物天然内源基因，无外源基因插入作物基因组中，不会产生对人畜有毒害的物质，不存在潜在的过敏原，不会产生抗营养因子。
28、本发明成功建立了花生乙酰乳酸合成酶作为筛选标记基因的转化和筛选体系，构建了基于筛选标记基因型的高通量鉴定方法，为以花生乙酰乳酸合成酶基因作为筛选标记基因在花生等作物上的应用奠定了基础。本发明建立的转基因后代鉴定和选择系统属于阳性选择系统，操作简单，不需要进行外源基因删除操作，选择时间短，效率高。
1.花生抗咪唑乙烟酸基因序列，其特征在于，花生乙酰乳酸合成酶编码基因的碱基序列如seq id no1所示，命名为ahals基因，所述的花生抗咪唑乙烟酸基因序列为如seq idno3所示的花生乙酰乳酸合成酶突变基因，命名为ahals-376突变基因，所述的ahals-376突变基因由2001个碱基组成；所述ahals基因编码的乙酰乳酸合成酶的蛋白序列如seq idno2所示，命名为als蛋白质序列，所述的ahals-376突变基因编码蛋白序列如seq id no4所示的突变型乙酰乳酸合成酶。
2.根据权利要求1所述的花生抗咪唑乙烟酸基因序列，其特征在于，所述的ahals-376突变基因由花生乙酰乳酸合成酶编码基因定点突变而来，所述的定点突变是指在所述的ahals基因序列的编码区第1113位碱基引入突变位点，使t突变成a；所述突变型乙酰乳酸合成酶的蛋白序列由所述的als蛋白质序列的第376位氨基酸由asp突变为glu得来。
3.根据权利要求1所述的花生抗咪唑乙烟酸基因序列，其特征在于，所述的定点突变是指对花生内源ahals基因序列进行pcr介导的定点突变，得到所述的ahals-376突变基因。
4.根据权利要求3所述的花生抗咪唑乙烟酸基因序列，其特征在于，在所述的pcr介导的定点突变之前，先要进行ahals基因的克隆，具体操作为：
5.根据权利要求3所述的花生抗咪唑乙烟酸基因序列，其特征在于，所述的pcr介导的定点突变指通过3次pcr介导实现定向突变，获得ahals-376突变基因，第一次pcr反应引物为：
6.根据权利要求5所述的花生抗咪唑乙烟酸基因序列，所述的s2步骤中的基因特异引物为所述的引物ahals-f和所述的引物ahals-r；
7.花生抗咪唑乙烟酸基因序列在植物转基因上的应用，所述的花生抗咪唑乙烟酸基因序列为权利要求1～5任意一项所述的基因序列，其特征在于，将所述的ahals-376突变基因作为筛选标记基因在转基因植物上的应用。
8.根据权利要求6所述的花生抗咪唑乙烟酸基因序列在植物转基因上的应用，其特征在于，将ahals-376突变基因导入到转基因植株中，经咪唑啉酮类除草剂筛选得到转基因植株。
9.根据权利要求6所述的花生抗咪唑乙烟酸基因序列在植物转基因上的应用，其特征在于，将ahals-376突变基因导入到拟南芥中指将ahals-376突变基因作为抗咪唑啉酮类除草剂的筛选标记基因插入到植物表达载体中，构建重组表达载体，然后将所述的重组表达载体通过农杆菌介导的方法转化到拟南芥植株中；所述的拟南芥植株在含有草铵膦和咪唑乙烟酸的筛选培养基上进行筛选，所述的草铵膦筛选浓度为9mg/l，咪唑乙烟酸浓度为1mg/l。
10.根据权利要求9所述的花生抗咪唑乙烟酸基因序列在植物转基因上的应用，其特征在于，所述构建重组表达载体具体方法为：将ahals基因和ahals-376突变基因克隆到pcambia3301植物表达载体上，利用组成型表达的camv 35s启动子驱动ahals基因和ahals-376突变基因，构建包含ahals基因和ahals-376突变基因的重组质粒表达载体，用电击法分别将所述的重组质粒表达载体转化农杆菌gv3101菌株，得到重组菌株，提取质粒进行pcr和酶切鉴定，分别获得内源基因ahals基因和带有抗性基因ahals-376突变基因的植物表达载体重组菌株；
