本发明涉及一种两性离子防污和双信号比率的电化学生物传感器的构建方法以及对疾病标志物甲胎蛋白检测的应用，属于生化传感分析和生命科学。
背景技术：
1、据统计，我国每年有超过10万人因肝癌失去生命。目前，肝癌的诊断主要依靠影像学检查和生物标志物检测。然而，影像学检查存在一定的局限性，在肝癌发展到一定程度才能被监测，导致许多患者在诊断时已经处于中晚期。为了更好的实现肝癌的早期筛查，对肝癌标志物的高效灵敏检测至关重要。甲胎蛋白(afp)是一种酸性糖蛋白，在正常人体内含量低，如果其水平超过25ng/ml，则有原发性肝癌的风险。因此，迫切需要开发一种高效的分析方法来检测人血清中的afp，这对肝癌的临床诊断与及时干预治疗具有重要意义。
2、电化学分析技术因其高灵敏度和特异性以及低成本的优点而被广泛应用于生物标志物检测。然而，除了目标分析物外，血清中还存在许多干扰生物分子，这些生物分子会发生非特异性吸附和生物氧化，从而影响电化学信号，这对靶标的精准检测提出了巨大挑战。基于此，开发高效的防污材料用于传感界面修饰以抵抗上述生物污染非常重要。
3、目前为止，聚乙二醇、多肽和两性离子已被报道具有抗污染性能。其中，聚乙二醇易于氧化和降解，多肽相对昂贵，两性离子因其强烈的水合作用而具有优异的防污能力，被视为防污材料的金标准。两性离子表面电荷与水分子之间的强水合作用能形成有序的强氢键水层，防止非特异性生物分子的表面吸附，这是决定其防污性能的关键。同时，相关研究表明，正负电荷基团之间的距离越短，两性离子的偶极越小，水合作用赋予的抗污染能力越强。然而，两性离子的主要缺点是难以合成和修饰，这限制了其在防污体系中的应用。为了应对上述挑战，本发明通过一步氧化法设计合成了一种氨基功能化的3-氨基丙基二甲胺氧化物(apdmao)作为高效的两性离子防污界面，一步合成策略和固有的官能团赋予了其易于合成和修饰的特性，从而解决了两性离子在电化学防污体系应用中的缺陷。
技术实现思路
1、本发明的技术任务之一是为了弥补现有技术的不足，制备一种基于apdmao两性离子的防污涂层，赋予传感界面高效的抗污染能力。
2、本发明的技术任务之二是构建一种两性离子防污和双信号比率的电化学生物传感器。
3、本发明的技术任务之三是提供所述的构建方法构建的两性离子防污和双信号比率的电化学生物传感器的用途，即实现肝癌标志物afp的灵敏精准检测，该电化学生物传感器具有较宽的线性范围和较低的检测限，以及优异的稳定性，特异性和重现性。
4、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
5、1.一种两性离子防污和双信号比率的电化学生物传感器的构建方法
6、将1～3mg/ml的多巴胺与2～8mg/ml的apdmao两性离子混合，然后将6μl的混合溶液滴到电极表面并孵育50min，得到修饰聚多巴胺-3-氨基丙基二甲胺氧化物(pda-apdmao)防污涂层的电极；配制含有5mm mg2+和0.5mm三(2-羧乙基)膦的afp适体-亚甲基蓝溶液；在所述afp适体-亚甲基蓝溶液中，以修饰pda-apdmao防污涂层的电极为工作电极，甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，利用恒电位法，将afp适体-亚甲基蓝偶联在pda-apdmao防污涂层表面；将所得工作电极置于afp溶液中孵育45min，然后在伴刀豆球蛋白-银纳米粒子(cona-ag nps)溶液中孵育1h，构建了具备pda-apdmao防污界面的双信号比率型电化学生物传感器；即两性离子防污和双信号比率的电化学生物传感器；
7、所述两性离子防污和双信号比率的电化学生物传感器，每个改性步骤后，均使用超纯水轻轻冲洗电极表面，以去除未结合的试剂；
8、所述apdmao两性离子，是将10g的3-二甲氨基吡咯胺溶于100ml超纯水中，充分搅拌后，滴加15ml质量分数为30％的h2o2，随后在60℃下用氧气吹扫6h，并在80℃下旋转蒸发，得到apdmao两性离子；
9、所述含有5mm mg2+和0.5mm三(2-羧乙基)膦的afp适体-亚甲基蓝溶液，是将234mg的nacl，41mg的mgcl2·6h2o，5mg的三(2-羧乙基)膦和97mg的三(羟甲基)氨基甲烷溶于40ml超纯水中，用浓度为1m的稀盐酸将溶液ph调至8.5，作为缓冲溶液备用；随后，将修饰亚甲基蓝的afp适体分散于15.4μl所述的缓冲溶液中，加热至95℃，保持3min，然后迅速冷却至室温，得到含有5mm mg2+和0.5mm三(2-羧乙基)膦的afp适体-亚甲基蓝溶液；
10、所述恒电位法偶联，电位为0.55v，偶联时间为500s；
11、所述afp溶液，其浓度分别为10fg/ml、100fg/ml、1pg/ml、10pg/ml、100pg/ml、1ng/ml、10ng/ml；
12、所述cona-ag nps溶液，是将0.1m的agno3滴加到含有10mm naoh和0.25mm柠檬酸钠的混合溶液中；持续搅拌至溶液变为亮黄色，加入谷胱甘肽；继续搅拌20min后，加入5.0μl辛二酸双(n-羟基琥珀酰亚胺酯)；继续加入10μl浓度为0.5mg/ml的cona溶液，孵育15min后，得到cona-ag nps溶液。
13、2.所述的构建方法构建的两性离子防污和双信号比率的电化学生物传感器的用途，用于肝癌标志物afp检测的应用
14、将修饰后的玻碳电极作为工作电极，甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为辅助电极构建三电极体系；将上述三电极体系连接在电化学工作站上，电压范围为-0.45～0.3v，振幅为50mv，脉冲宽度为0.05s；使用ph为6.5～8.5的磷酸缓冲盐溶液作为检测底液，利用三电极体系检测不同浓度afp下的电化学信号；根据所得电化学信号与afp浓度对数的线性关系绘制工作曲线；构建的电化学防污生物传感器具有良好的稳定性、特异性以及重现性，在10fg/ml～10ng/ml的宽动态范围内实现了对afp的灵敏精准检测，检测限低至3.41fg/ml。
15、本发明的有益的技术效果：
16、1.本发明制得了一种基于apdmao两性离子的高效防污涂层，两性离子作为同一分子上同时带正负两种电荷的偶极离子，其表面电荷与水分子之间的强水合作用可以形成有序的强氢键水层，防止非特异性生物分子的表面粘附，极大提升了界面抗污能力；同时，apdmao解决了两性离子难于合成和修饰的缺陷，促进了两性离子防污材料在电化学生物传感分析中的应用。
17、2.本发明构建了一种两性离子防污和双信号比率的电化学生物传感器，亚甲基蓝作为内标修饰的含硫醇的afp适体在可控电位下与apdmao偶联，既缩短了适体孵育时间，又提高了传感器的检测精度。
18、3.本发明构建的两性离子防污和双信号比率的电化学生物传感器展现出优异的防污性能，以及高的稳定性、特异性、重现性，实现了对血清中肝癌标志物afp的灵敏精准检测。
1.一种两性离子防污和双信号比率的电化学生物传感器的构建方法，其特征在于，将1～3mg/ml的多巴胺与2～8mg/ml的3-氨基丙基二甲胺氧化物两性离子混合，然后将6μl的混合溶液滴到电极表面并孵育50min，得到修饰聚多巴胺-3-氨基丙基二甲胺氧化物防污涂层的电极；配制含有5mm mg2+和0.5mm三(2-羧乙基)膦的甲胎蛋白适体-亚甲基蓝溶液；在所述甲胎蛋白适体-亚甲基蓝溶液中，以修饰聚多巴胺-3-氨基丙基二甲胺氧化物防污涂层的电极为工作电极，甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，利用恒电位法，将甲胎蛋白适体-亚甲基蓝偶联在聚多巴胺-3-氨基丙基二甲胺氧化物防污涂层表面；将所得工作电极置于甲胎蛋白溶液中孵育45min，然后在伴刀豆球蛋白-银纳米粒子溶液中孵育1h，构建了具备聚多巴胺-3-氨基丙基二甲胺氧化物防污界面的双信号比率型电化学生物传感器；即两性离子防污和双信号比率的电化学生物传感器；
2.如权利要求1所述的两性离子防污和双信号比率的电化学生物传感器的构建方法，其特征在于，所述3-氨基丙基二甲胺氧化物两性离子，是将10g的3-二甲氨基吡咯胺溶于100ml超纯水中，充分搅拌后，滴加15ml质量分数为30％的h2o2，随后在60℃下用氧气吹扫6h，并在80℃下旋转蒸发，得到3-氨基丙基二甲胺氧化物两性离子。
3.如权利要求1所述的两性离子防污和双信号比率的电化学生物传感器的构建方法，其特征在于，所述含有5mm mg2+和0.5mm三(2-羧乙基)膦的甲胎蛋白适体-亚甲基蓝溶液，是将234mg的nacl，41mg的mgcl2·6h2o，5mg的三(2-羧乙基)膦和97mg的三(羟甲基)氨基甲烷溶于40ml超纯水中，用浓度为1m的稀盐酸将溶液ph调至8.5，作为缓冲溶液备用；随后，将修饰亚甲基蓝的甲胎蛋白适体分散于15.4μl所述的缓冲溶液中，加热至95℃，保持3min，然后迅速冷却至室温，得到含有5mm mg2+和0.5mm三(2-羧乙基)膦的甲胎蛋白适体-亚甲基蓝溶液。
4.如权利要求1所述的两性离子防污和双信号比率的电化学生物传感器的构建方法，其特征在于，所述恒电位法偶联，电位为0.55v，偶联时间为500s。
5.如权利要求1所述的两性离子防污和双信号比率的电化学生物传感器的构建方法，其特征在于，所述甲胎蛋白溶液，其浓度分别为10fg/ml、100fg/ml、1pg/ml、10pg/ml、100pg/ml、1ng/ml、10ng/ml。
6.如权利要求1所述的两性离子防污和双信号比率的电化学生物传感器的构建方法，其特征在于，所述伴刀豆球蛋白-银纳米粒子溶液，是将0.1m的agno3滴加到含有10mm naoh和0.25mm柠檬酸钠的混合溶液中；持续搅拌至溶液变为亮黄色，加入谷胱甘肽；继续搅拌20min后，加入5.0μl辛二酸双(n-羟基琥珀酰亚胺酯)；继续加入10μl浓度为0.5mg/ml的伴刀豆球蛋白溶液，孵育15min后，得到伴刀豆球蛋白-银纳米粒子溶液。
7.如权利要求1所述的构建方法构建的两性离子防污和双信号比率的电化学生物传感器的用途，用于肝癌标志物afp检测的应用。
