本发明涉及分子生物学及基因工程领域，涉及螯虾卵细胞引导肽、融合蛋白、核酸分子、重组表达载体、宿主细胞、引导外源蛋白进入螯虾卵细胞的方法及其应用。
背景技术：
1、螯虾（如克氏原螯虾）作为全球重要的水产养殖物种，在生物学研究、育种改良及生物技术应用中具有重要价值。然而，螯虾等甲壳类动物的基因编辑技术长期面临诸多挑战，尤其是在如何将外源基因编辑工具（如crispr-cas9系统）有效递送至卵母细胞或胚胎细胞方面。这一难题极大地限制了基因编辑技术在螯虾等物种中的应用。
2、常见的基因编辑工具，如crispr-cas9、talens或zfn，依赖于高效的递送系统，确保其在目标细胞内发挥作用。传统的方法主要基于对胚胎进行显微注射，其依赖于昂贵的仪器、专业的人员及成熟的体系等，并且效率低且具有物种局限性。因此，该方法难以广泛应用于螯虾的研究和生产中。
3、在昆虫和其他节肢动物中，卵细胞和卵巢发育时，会通过受体介导的内吞作用大量吸收卵黄蛋白原进入卵细胞，以为卵的发育提供营养。而卵黄蛋白原上的一段可被受体识别的序列是决定该内吞作用的关键，这段多肽也因此有引导其他外源蛋白进入卵细胞的潜力。基于此，在2018年，宾夕法尼亚州大学的rasgon研究团队开发了一种名为“受体介导卵巢转导货物”（remot control）的方法，利用一种名为p2c的多肽将crispr-cas9核糖核蛋白（rnp）递送至蚊子的生殖系，成功实现了可遗传的基因编辑。因此，remot control 技术的开发为外源蛋白递送至其他节肢类卵细胞，甚至实现基因编辑提供了可能性。然而，目前remot control技术中已使用的多肽并不具有普适性，难以直接普遍应用，需要针对特定物种筛选优化特定的引导肽。因此，为实现将外源蛋白有效引导进入螯虾卵细胞，以探索remot control基因编辑技术在螯虾中的应用、以及研究其他蛋白质在螯虾卵细胞中的功能，亟需进行特异性的序列筛选和优化，以找到能够有效引导外源蛋白进入螯虾卵细胞的多肽。
技术实现思路
1、为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供螯虾卵细胞引导肽、融合蛋白、核酸分子、重组表达载体、宿主细胞、引导外源蛋白进入螯虾卵细胞的方法及其应用，本发明使用绿色荧光蛋白（egfp）作为示例蛋白，证明该多肽能够成功递送外源蛋白。这一突破能为基因编辑工具（如crispr-cas9系统）引入螯虾卵母细胞奠定技术基础，有望在螯虾育种、功能基因研究及水产养殖基因改良等领域广泛应用。
2、为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
3、首先，本发明提供了一种螯虾卵细胞引导肽，氨基酸序列为dknvvrpsygaykyiegkqestfrggggsggggsggggs，如seq id no.1所示。
4、经过实验表明，本发明提供的上述螯虾卵细胞引导肽能够将外源蛋白导入至螯虾卵细胞内，并且保留外源蛋白的功能，同时能够使该外源蛋白在螯虾卵细胞内发挥相应作用。
5、其次，本发明还提供了一种融合蛋白，由n端至c端依次包括本发明上述的螯虾卵细胞引导肽和外源蛋白。
6、在一些实施方案中，所述外源蛋白为绿色荧光蛋白（egfp）。
7、本发明还提供了一种核酸分子，所述核酸分子用于编码本发明上述的融合蛋白。
8、本发明所述的核酸分子的编码核酸序列经过密码子优化。本发明根据表达的工程菌对所述核酸分子的密码子进行优化。
9、在一些实施方案中，所述核酸分子中用于编码所述螯虾卵细胞信号肽的核酸序列为：gataaaaatgttgttcgtccgagctatggtgcctataaatatattgaaggtaaacaggaaagcaccttccgtggtggtggcggcagcggtggtggcggcagcggtggtggcggcagc，如seq id no.2所示。
10、本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有本发明上述的核酸分子。
11、本发明所述的重组表达载体通过上述核酸分子有效地连接到表达载体上获得，所述表达载体为质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、病毒载体、f黏粒等中的任意一种或多种。具体地，所述重组表达载体可通过单片段扩增分别获得螯虾卵细胞信号肽和外源蛋白的编码区基因片段之后对表达载体分段连接获得，亦可通过将编码上述螯虾卵细胞信号肽及外源蛋白的基因构建成融合基因（即上述核酸分子）之后连接表达载体以获得。在一些实施方案中，表达载体为质粒。更为具体地，所述质粒包括但不限于pet（如pet-28a、pet-30a或pet-32a等）或pgex（如pgex-4t-1等）等。本发明采用上述质粒更有利于其在工程菌中的表达。
12、本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述重组表达载体或核酸分子。
13、本发明所述的宿主细胞可通过化学转化法或电击法将重组表达载体导入宿主细胞中获得。
14、本发明所述的宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，具体地，可以为细菌细胞、真菌细胞或植物细胞中的任意一种或多种，更为具体地，包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酿酒酵母或链霉菌等。
15、为了获得目标宿主细胞，需要通过筛选阳性克隆验证。所述筛选可基于抗生素筛选、蓝白斑筛选、pcr筛选、酶切筛选或测序筛选等，在此不做限定，可根据实际情况选择。
16、本发明提供的上述核酸分子、重组表达载体或宿主细胞的目的，均是为了表达上述融合蛋白。诱导宿主细胞表达融合蛋白时，可基于iptg诱导、ph/温度诱导、酯类化合物诱导或金属离子诱导等，在此不做限定，可根据表达载体及工程菌特性灵活选择。宿主细胞表达融合蛋白后，可通过对宿主细胞进行超声破碎及亲和层析处理后获得。具体地，所述亲和层析可以是镍亲和层析、谷胱甘肽亲和层析或金属螯合层析等，在此不做限定，可根据蛋白质特性选择。
17、本发明还提供了一种引导外源蛋白进入螯虾卵细胞的方法，提供上述螯虾卵细胞引导肽，将所述螯虾卵细胞引导肽与外源蛋白重组为重组蛋白，或提供上述融合蛋白；将所述重组蛋白或融合蛋白注射进螯虾血淋巴中。
18、本发明所述注射可通过微量注射器。在一些实施方案中，注射位置包括但不限于尾部腹侧、步足基部、头胸部背侧或腹侧。
19、在一些实施方案中，所述螯虾为处于性腺成熟期的雌虾。
20、在一些实施方案中，所述螯虾为克氏原螯虾（小龙虾）。
21、本发明还提供了一种上述螯虾卵细胞引导肽、融合蛋白、核酸分子、重组表达载体、宿主细胞或方法在螯虾的基因编辑中的应用。
1.一种螯虾卵细胞引导肽，其特征是，氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.一种融合蛋白，其特征是，由n端至c端依次包括权利要求1所述的螯虾卵细胞引导肽和外源蛋白。
3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征是，所述外源蛋白为绿色荧光蛋白。
4.一种核酸分子，其特征是，所述核酸分子用于编码权利要求2或3所述的融合蛋白。
5.如权利要求4所述的核酸分子，其特征是，所述核酸分子中用于编码所述螯虾卵细胞信号肽的核酸序列如seq id no.2所示。
6.一种重组表达载体，其特征是，所述重组表达载体含有权利要求4或5所述的核酸分子。
7.如权利要求6所述的重组表达载体，其特征是，表达载体为质粒。
8.一种宿主细胞，其特征是，所述宿主细胞含有权利要求6或7所述的重组表达载体或权利要求4或5所述的核酸分子。
9.一种引导外源蛋白进入螯虾卵细胞的方法，其特征是，提供权利要求1所述的螯虾卵细胞引导肽，将所述螯虾卵细胞引导肽与外源蛋白重组为重组蛋白，或提供权利要求2或3所述的融合蛋白；将所述重组蛋白或融合蛋白注射进螯虾血淋巴中。
10.一种权利要求1所述的螯虾卵细胞引导肽、权利要求2或3所述的融合蛋白、权利要求4或5所述的核酸分子、权利要求6或7所述的重组表达载体、权利要求7或8所述的宿主细胞或权利要求9所述的方法在鳌虾的基因编辑中的应用。
