本发明犬呼吸多重病原体的检测领域，具体涉及一种用于检测犬呼吸多重病原体的核酸组合物及其试剂盒和方法。
背景技术：
1、称为犬传染性呼吸道疾病（cirdc），是一种复杂的传染病，其症状表现为传染性气管支气管炎，主要特征是严重的干咳，可能伴有眼鼻分泌物。这种疾病具有极强的传染性，常导致全窝动物出现症状。病原体的传播途径包括气溶胶途径，能够引起亚临床或轻度的上呼吸道症状，平均持续1至2周。在近20年中，已经报道了新病原体引起的临床症状的急性发作，包括犬疱疹病毒-1和犬流感病毒。
2、其中，犬疱疹病毒1型( canine herpesvirus 1，chv-1)是水痘病毒属的一种有包膜的双链dna病毒。chv-1的宿主范围仅限于家养和野生犬科动物。chv-1在世界各地的犬中很常见，感染导致犬的生殖障碍和新生儿死亡。chv-1主要通过唾液、鼻汁、尿液向外排毒，通过呼吸道、消化道和生殖道进行传播；chv-1在产道中或通过直接接触粘膜分泌物传播给新生幼犬。临床症状因受感染动物的年龄和免疫力而异。新生幼犬特别容易感染chv-1，由于病毒的全身传播，容易发展为致命的全身性坏死性和出血性疾病，其特征是厌食、呼吸困难、腹痛、身体不协调、腹泻、浆液性或出血性鼻分泌物和粘膜点状出血。21日龄以上的犬，无症状或轻度和亚临床自限性感染最常见。怀孕母犬感染导致胎儿死亡、流产、木乃伊化和死产。呼吸道疾病、眼部症状和生殖器病变也有报告。chv-1与其他的疱疹病毒一样，潜伏在神经组织中，在因剧烈应激或药物造成免疫抑制后，可发生潜伏病毒的重新感染，患犬终身通过呼吸道分泌物间歇性排毒。目前尚无有效疫苗。犬疱疹病毒病一旦发生，对犬的繁殖和养殖等产业均会造成严重的经济损失。
3、目前，检测chv-1的方法有病毒培养、病理组织学、电镜检查等方法。但现有技术对chv-1的检测灵敏度均不高，而且操作复杂、结果准确性差。聚合酶链反应(pcr)是最敏感和最特异的技术之一，特别是对于潜伏感染的检测，而本领域尚未见能够快速、准确、高特异性和灵敏度的检测chv-1的pcr方法。
4、因此，本领域亟需一种耗时短、特异性强、重复性好、灵敏度高的犬疱疹病毒1型的pcr检测试剂及其检测方法，为检测犬疱疹病毒1型提供可靠的实验依据。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提供了引物对、crrna、用于扩增犬呼吸多重病原体核酸序列的核酸组合物、rpa扩增试剂、crispr试剂、检测试剂盒、检测方法及应用，以至少一定程度上解决上述技术问题之一。
2、本发明目的之一提供一种引物对，所述引物对如seq id no:12和13所示，所述引物对用于扩增如seq id no:1所示的核苷酸序列。
3、本发明目的之一提供一种crrna，其核苷酸序列如seq id no:4~6任一所示，所述crrna用于引导核酸酶cas13a靶向引导核酸酶cas13a靶向如seq id no:1所示的核苷酸序列。
4、本发明目的之一提供用于检测犬呼吸多重病原体的核酸组合物，包括所述引物对和所述的crrna。
5、本发明目的之一提供用于扩增犬呼吸多重病原体核酸序列的rpa扩增试剂，包含:75 mm tris，50mm 醋酸钾，25mm 醋酸镁，25mm β巯基乙醇，3.5%聚乙二醇-2000，2mm atp，20mm 多聚磷酸，50ng/μl 多聚磷酸激酶，250 nm的如seq id no:12上游引物，250 nm 的如seq id no:13下游引物，300ng/μl tthreca蛋白，600 ng/μl tthssb蛋白和0.26u/μlbst3.0 dna聚合酶。
6、本发明目的之一提供用于引导核酸酶cas13a靶向切割的crispr试剂，包含12.5ng/μl lwacas13a、10ng/μl 如所述的crrna、2 μm荧光报告 rna、5 u/μl t7 rna 聚合酶、1 m hepes、1 m溶液、25mm0 rntp mix、40 u/ml 1 μl rna 酶抑制剂和无酶水。
7、具体地，所述crispr试剂以19μl计包含：2 μl lwacas13a（12.5ng/μl）、1 μl 所述crrna（10ng/μl）、1.25 μl 荧光报告 rna（2 μm）、0.5 μl t7 rna 聚合酶（5 u/μl）、0.4 μlhepes 缓冲液（1 m）、0.18 μl mgcl2 溶液（1 m）、0.8 μl rntp mix（25mm atp、gtp、utp、ctp）、1 μl rna 酶抑制剂（40 u/ml）和 11.87 μl 无酶水。
8、本发明目的之一提供用于引导核酸酶cas13a靶向切割的crispr试剂，包含12.5ng/μl lwacas13a、10ng/μl 所述crrna、2 μm荧光报告 rna、5 u/μl t7 rna 聚合酶、1m hepes、1 m溶液、25mm0 rntp mix、40 u/ml 1 μl rna 酶抑制剂、10mm对氨基苯甲酰氨基苯甲酰胺和无酶水。
9、具体地，所述crispr试剂以19μl计包含：2 μl lwacas13a（12.5ng/μl）、1 μl所述的crrna（10ng/μl）、1.25 μl 荧光报告 rna（2 μm）、0.5 μl t7 rna 聚合酶（5 u/μl）、0.4μl hepes 缓冲液（1 m）、0.18 μl mgcl2 溶液（1 m）、0.8 μl rntp mix（25mm atp、gtp、utp、ctp）、1 μl rna 酶抑制剂（40 u/ml）、1 μl对氨基苯甲酰氨基苯甲酰胺（10mm）和10.87μl 无酶水。
10、本发明目的之一提供一种犬呼吸多重病原体的检测试剂盒，包括30μl的所述rpa扩增试剂以及19μl的所述crispr试剂。
11、本发明目的之一提供一种犬呼吸多重病原体的检测方法，包括：取1μl加入30μl的所述rpa扩增试剂和19μl的所述crispr试剂，充分混匀之后，将反应体系加入荧光定量pcr管中，上机检测。
12、本发明目的之一提供所述引物、所述crrna、所述rpa扩增试剂或所述crispr试剂在制备检测犬呼吸多重病原体试剂盒中的应用。
13、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
14、本发明提供的检测犬呼吸多重病原体的引物，针对ul54基因的特殊序列（seq idno:1）进行扩增，扩增得到特异性强，灵敏度高，能够用于犬呼吸多重病原体核酸的检测。
15、本发明提供的引导核酸酶cas13a靶向切割的crrna，靶向性强（靶向seq id no:1区域），能够有效引导核酸酶cas13a进行靶向切割进而被放大产生强烈的荧光信号。并且，相对于靶向seq id no:7区域的crrna具有更强的靶向性和特异性。
16、本发明提供的rpa试剂、crispr试剂能够被制备成为冻干品，便于运输，可以室温运输和低温保存，该冻干品包括检测犬呼吸多重病原体的引物，复溶后能够用于犬呼吸多重病原体核酸的检测，使用方便。
17、本发明提供的用于检测犬呼吸多重病原体的试剂盒该试剂盒利用rpa扩增试剂能够直接对临床样本进行有效扩增，扩增产物经crispr试剂实现靶向切割产生荧光信号，根据荧光信号定性或定量检测犬呼吸多重病原体。该试剂盒的使用及操作简单，检测人员只需加样即可检测，减少配液过程导致的错误和偏差，不需要专业技术人员。
18、本发明提供的检测试剂盒及检测方法灵敏度高，最低可检测1×10-9ng/μl的犬呼吸多重病原体的核酸样本。
19、本发明提供的检测试剂盒及检测方法特异性强，能够有效识别和检测犬呼吸多重病原体，检出率高，并能够避免和减少腺病毒2型和犬副流感病毒的干扰，具有高检测特异性。
1.rpa扩增试剂和crispr试剂在制备检测犬呼吸多重病原体的试剂盒中的应用；
2.根据权利要求1所述的应用，所述crispr试剂以19μl计包含：2 μl12.5ng/μl 的lwacas13a，1 μl 10ng/μl的所述crrna，1.25 μl 2 μm的荧光报告 rna，0.5 μl 5 u/μl的t7 rna 聚合酶，0.4 μl 1 m的hepes 缓冲液，0.18 μl 1 m的mgcl2 溶液，0.8 μl含25mmatp、25mm gtp、25mm utp及25mm ctp的rntp mix，1 μl 40 u/ml的 rna 酶抑制剂和11.87μl 无酶水。
3.根据权利要求1所述的应用，所述crispr试剂以19μl计包含：2 μl 12.5ng/μl的lwacas13a，1 μl10ng/μl的所述crrna，1.25 μl 2 μm的荧光报告 rna，0.5 μl 5 u/μl的t7rna 聚合酶，0.4 μl 1 m的hepes 缓冲液，0.18 μl 1 m的mgcl2溶液，0.8 μl含25mm atp、25mm gtp、25mm utp及25mm ctp的rntp mix，1 μl 40 u/ml的rna 酶抑制剂，1 μl 10mm的对氨基苯甲酰氨基苯甲酰胺和10.87 μl无酶水。
4.根据权利要求1所述的应用，所述检测犬呼吸多重病原体的试剂盒包括30μl的所述rpa扩增试剂，以及19μl的所述crispr试剂。
