本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及结合dna条形码的二代测序引物对及测序方法。
背景技术：
1、现今的生物基因工程领域几乎就是和无数的序列打交道，而这些序列的来源就是如今风靡的高通量测序技术，现今的测序不论是测rna、dna、mirna还是chip-seq等等，都是基于ngs（二代测序，next-generation sequencing）的技术发展而来的，目前最为常用的就是illumina公司的测序技术，当然除了illumina公司外还是有其它二代测序技术存在的，abi公司也有solid测序技术。而之所以被称为二代测序，是因为比一代测序技术提升了非常多，具体体现在速度、准确性、效率等等方面。
2、二代测序的一般流程如下：
3、1）文库制备，将dna用雾化或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把dna片段切成平末端，紧接着磷酸化并增加一个核苷酸黏性末端。然后将测序接头与片段连接；
4、2）簇的创建，将模板分子加入芯片用于产生克隆簇和测序循环。芯片有8个纵向泳道的硅基片。每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的dna片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。通过不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段；
5、3）测序，dna聚合酶结合荧光可逆终止子，荧光标记簇成像，在下一个循环开始前将结合的核苷酸剪切并分解；
6、4）数据分析，测序得到的原始数据是长度为几十个碱基的序列，要通过生物信息学工具将这些短的序列组装成长的contigs甚至是整个基因组的框架，或者把这些序列比对到已有的基因组或者相近物种基因组序列上，进一步分析得到有生物学意义的结果。聚合酶链反应（pcr）是一种广泛运用于分子遗传和诊断的技术，用于放大扩增特定的dna片段，可看作是生物体外的特殊dna复制，可分析任何短的dna序列，pcr的最大特点，是能将微量的dna大幅增加，即使样品中只含有低水平的dna。pcr技术可用于扩增分析用的dna或rna选定片段。
7、dna条形码（barcode）是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的dna片段，其增强人类监测、了解和利用生物多样性资源的能力，其在生命科学、法医学、流行病学，以及医药、食品质量控制等领域均具有广泛的应用前景。
8、目前市场上二代测序仍然存在测序时间长和测序产出的数据量不均一的缺点，严重的增加了时间和经济成本。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明创造的目的是提供一种根据chambon法则设计的结合dna条形码的二代测序引物对，所述引物对适用的物种数目多，检测结果准确可靠。具体的：
2、所述引物对包括左引物和右引物；所述引物包括ta[barcode]区域和保守序列结合区域；左引物保守序列结合区域由5’至3’端为aggtgagtn，对应的右引物保守序列结合区域由5’至3’端为ccttctn，或左引物保守序列结合区域由5’至3’端为ccttctn，对应的右引物保守序列结合区域由5’至3’端为aggtgagtn，其中n为随机碱基；所述ta[barcode]区域连接于左引物或右引物5’端。
3、本发明还有一个目的是提供一种基因组二代测序方法，包括如下步骤：
4、提取每个待测序样本的dna；待测样本为动物或植物或真菌；
5、对每个待测序样本的dna进行pcr扩增，扩增引物对包括左引物和右引物，所述引物包括ta[barcode]区域和保守序列结合区域，左引物保守序列结合区域由5’至3’端为aggtgagtn，对应的右引物保守序列结合区域由5’至3’端为ccttctn，或左引物保守序列结合区域由5’至3’端为ccttctn，对应的右引物保守序列结合区域由5’至3’端为aggtgagtn，其中n为随机碱基，所述ta[barcode]区域连接于左引物或右引物5’端；每个待测序样本使用的引物对中的barcode不同；
6、对pcr产物定量使其保持浓度一致再混合；
7、采用二代建库测序分析结果，待测序样本区分通过barcode实现，将测序数据映射到参考基因组或者单独组装，挖掘群体变异位点。
8、作为本发明更优的技术方案，所述待测序样本的dna提取方法为ctab法、sds法或磁珠法。
9、作为本发明更优的技术方案，所述待测序样本进行pcr扩增过程包括结合扩增和富集扩增；将引物结合到基因组上为结合扩增，其前9个循环分别在94℃，45秒，30℃，1分钟，72℃，20秒进行；富集扩增是将退火温度升至50℃进行30个循环。
10、作为本发明更优的技术方案，所述对pcr产物定量的浓度为200ng/ul。
11、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
12、本发明提供的引物对根据chambon法则找到目的基因附近的区域设计，适用的物种数目多，检测结果准确可靠。
13、本发明提供的测序方法，文库制备时间减少，利用多个barcode同时测序，减少成本以及增加速率，根据pcr扩增后的结果混样测序，能使测序产出的数据量较均一。
1.一种结合dna条形码的二代测序引物对，其特征在于：所述引物对包括左引物和右引物，所述引物包括ta[barcode]区域和保守序列结合区域；
2.一种基因组二代测序方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述基因组二代测序方法，其特征在于：所述待测序样本的dna提取方法为ctab法、sds法或磁珠法。
4.根据权利要求2所述基因组二代测序方法，其特征在于：所述待测序样本进行pcr扩增过程包括结合扩增和富集扩增；将引物结合到基因组上为结合扩增，其前9个循环分别在94℃，45秒，30℃，1分钟，72℃，20秒进行；富集扩增是将退火温度升至50℃进行30个循环。
5.根据权利要求2所述基因组二代测序方法，其特征在于：所述对pcr产物定量的浓度为200ng/ul。
