本发明属于医学检验，具体涉及一种基于苯甲酰氯化学衍生后液质联用测定人的体液中莫诺拉韦和/或其活性代谢物β-d-n4-羟基胞苷浓度的方法。
背景技术：
1、本研究经过文献检索，仅发现4篇文献[1～4]测定人血浆中莫诺拉韦和、或其活性代谢产物β-d-n4-羟基胞苷浓度，其中同时测定莫诺拉韦和其活性代谢产物β-d-n4-羟基胞苷仅有1篇。更值得重视的是，这些方法大多具有的一个共同的缺点是：为了达到较高的灵敏度，在预处理过程中采用了干燥复溶过程，这使得前处理操作复杂且耗时。其中，gouda as等[1]通过真空蒸发后复溶的方式浓缩样品，尽管使得β-d-n4-羟基胞苷定量下限得到改善达到了20ng·ml-1，但在对健康志愿者用药后0.25～12h的药动学分析中仍有11.4％的患者血药浓度低于定量限。komarov t等[2]的方法虽直接采用2倍样品体积的乙腈蛋白沉淀，预处理较为简单，但蛋白沉淀剂所用比例过低可能导致血浆蛋白沉淀不充分，易堵塞色谱柱和仪器管路，并且其研究中不同浓度下的样品回收率和基质效应差异较大，表明预处理方法不够合适。
2、参考文献
3、[1]gouda as,marzouk hm,rezk mr,salem am,morsi mi,nouman eg,abdallahym,hassan ay and abdel-megied am(2022)a validated lc-ms/ms method fordetermination of antiviral prodrug molnupiravir in human plasma and itsapplication for a pharmacokinetic modeling study in healthy egyptianvolunteers.j chromatogr b analyt technol biomed life sci 1206:123363.
4、[2]komarov,t,karnakova,p,archakova,o,shchelgacheva,d,bagaeva,n,popova,m,karpova,p,zaslavskaya,k,bely,p,and shohin,i(2023).development andvalidation of a high-performance liquid chromatography with tandem massspectrometry(hplc-ms/ms)method for quantification of major molnupiravirmetabolite(β-d-n4-hydroxycytidine)in human plasma.biomedicines,11(9),2356.)
5、[3]amara a,penchala sd,else l,hale c,fitzgerald r,walker l,lyons r,fletcher t and khoo s(2021)the development and validation of a novel lc-ms/msmethod for the simultaneous quantification of molnupiravir and its metabolitess-d-n4-hydroxycytidine in human plasma and saliva.j pharm biomed anal 206:114356.
6、[4]parsons tl,kryszak la and marzinke ma(2021)development andvalidation of assays for the quantification of beta-d-n(4)-hydroxycytidine inhuman plasma and beta-d-n(4)-hydroxycytidine-triphosphate in peripheral bloodmononuclear cell lysates.j chromatogr b analyt technol biomed life sci 1182:122921.
技术实现思路
1、本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种基于苯甲酰氯化学衍生后液质联用测定人的体液中莫诺拉韦和/或其活性代谢物β-d-n4-羟基胞苷浓度的方法。
2、本发明提供了一种基于苯甲酰氯化学衍生后液质联用测定人的体液中莫诺拉韦和/或其活性代谢物β-d-n4-羟基胞苷浓度的方法，具有这样的特征：以衍生化试剂苯甲酰氯与人的体液样品中的莫诺拉韦和/或β-d-n4-羟基胞苷反应生成相应的衍生化产物，从而间接测定体液样品中的莫诺拉韦和/或β-d-n4-羟基胞苷的浓度，以同位素取代的衍生化试剂苯甲酰氯-d5试剂与莫诺拉韦和/或β-d-n4-羟基胞苷反应生成相应的氘代衍生化产物作为内标。
3、在本发明提供的基于苯甲酰氯化学衍生后液质联用测定人的体液中莫诺拉韦和/或其活性代谢物β-d-n4-羟基胞苷浓度的方法中，还可以具有这样的特征：其中，体液样品中的体液为唾液、尿液、血浆、组织液、淋巴液、脑脊液中的任意一种。
4、在本发明提供的基于苯甲酰氯化学衍生后液质联用测定人的体液中莫诺拉韦和/或其活性代谢物β-d-n4-羟基胞苷浓度的方法中，还可以具有这样的特征：其中，体液样品为以莫诺拉韦和/或β-d-n4-羟基胞苷标准品与体液混合配制得到的样品，或为从服用了莫诺拉韦的人体获取的新鲜体液。
5、在本发明提供的基于苯甲酰氯化学衍生后液质联用测定人的体液中莫诺拉韦和/或其活性代谢物β-d-n4-羟基胞苷浓度的方法中，还可以具有这样的特征，该方法包括以下步骤：
6、步骤1，制备内标溶液：
7、向有机试剂中加入莫诺拉韦储备液和/或β-d-n4-羟基胞苷储备液，并加入苯甲酰氯-d5试剂，涡旋混匀，在预定温度下反应预定时间后，进一步加入有机试剂稀释至最终浓度；
8、步骤2，体液样品预处理及样品中待测物衍生化：
9、将体液样品置于离心管中，加入含预定浓度的苯甲酰氯的有机试剂沉淀蛋白，从而在提取莫诺拉韦储备液和/或β-d-n4-羟基胞苷的同时进行化学衍生，离心后，吸取定量上清液，加入内标溶液和水，得到待测混合溶液；
10、步骤3，样品分离：
11、将待测混合溶液采用苯基高效液相色谱柱进行液相色谱分离，液相色谱系统为高压计量泵、控温柱温箱和自动进样器，并采用乙腈和水作为流动相，梯度洗脱，得到待测样品；
12、步骤4，串联质谱检测和浓度计算：
13、采用串联质谱检测器检测待测样品中莫诺拉韦储备液和/或β-d-n4-羟基胞苷的衍生化产物的峰面积as以及内标的峰面积ai，以莫诺拉韦储备液和/或β-d-n4-羟基胞苷的浓度作为x轴，衍生化产物的峰面积as与内标的峰面积ai的比值为y轴，进行加权回归分析，标准曲线回归方程以及莫诺拉韦储备液和/或β-d-n4-羟基胞苷的浓度使用含量分析软件进行计算。
14、在本发明提供的基于苯甲酰氯化学衍生后液质联用测定人的体液中莫诺拉韦和/或其活性代谢物β-d-n4-羟基胞苷浓度的方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤1中，有机溶剂为乙腈，预定温度为室温，预定时间为9-12min。
15、在本发明提供的基于苯甲酰氯化学衍生后液质联用测定人的体液中莫诺拉韦和/或其活性代谢物β-d-n4-羟基胞苷浓度的方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤2中，有机试剂为乙腈，预定浓度为1％(v/v)，离心的转速为13000rpm。
16、在本发明提供的基于苯甲酰氯化学衍生后液质联用测定人的体液中莫诺拉韦和/或其活性代谢物β-d-n4-羟基胞苷浓度的方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤2中，体液样品与含预定浓度的苯甲酰氯的有机试剂的体积比为1:3，上清液、内标溶液、水的体积比为20:1:10。
17、在本发明提供的基于苯甲酰氯化学衍生后液质联用测定人的体液中莫诺拉韦和/或其活性代谢物β-d-n4-羟基胞苷浓度的方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤3中，苯基高效液相色谱柱为agilent eclipse plus phenyl-hexyl柱(4.6×250mm，5μm)，
18、流动相为乙腈：水，其梯度为：0.01～0.5min，30％乙腈，0.5～8.0min，30～58％乙腈，8.0～8.1min，58～90％乙腈，8.1～9.0min，90％乙腈，9.0～9.6min，90～30％乙腈，9.6～10min，30％乙腈，流速1ml·min-1。
19、在本发明提供的基于苯甲酰氯化学衍生后液质联用测定人的体液中莫诺拉韦和/或其活性代谢物β-d-n4-羟基胞苷浓度的方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤4中，串联质谱检测器为通用型串联质谱检测器，质谱电离方式为：电喷雾电离源，扫描方式为：多反应监测(mrm)正离子模式，离子通道为：m/z 434.2→105.2(莫诺拉韦衍生化产物)、m/z364.2→105.3(β-d-n4-羟基胞苷衍生化产物)、m/z 439.2→110.1(内标，莫诺拉韦氘代衍生化产物)和m/z 369.2→110.0(内标，β-d-n4-羟基胞苷氘代衍生化产物)。
20、在本发明提供的基于苯甲酰氯化学衍生后液质联用测定人的体液中莫诺拉韦和/或其活性代谢物β-d-n4-羟基胞苷浓度的方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤4中，质谱设定参数为：电喷雾电压5500v，离子源温度700℃，气帘气25arb，碰撞气ar气压力为medium，离子源气体1和2分别为65psi和45psi，莫诺拉韦衍生化产物、β-d-n4-羟基胞苷衍生化产物、莫诺拉韦氘代衍生化产物和β-d-n4-羟基胞苷氘代衍生化产物的dp电压分别为36ev、38ev、36ev和27ev，碰撞能量分别为33ev、31ev、46ev和40ev，扫描时间为200ms。
21、本发明的技术效果如下：
22、本发明在前人研究基础上，采用苯甲酰衍生化方法提高了待测物的检测灵敏度，并且本发明创新性地采用含苯甲酰氯的乙腈进行蛋白沉淀预处理的方式，使得待测物提取与衍生化同步进行，较现有文献报道的预处理过程更简单、快捷。
23、本发明解决了目前缺少同时具备高灵敏度、简单快速的预处理过程和简单通用的流动相的莫诺拉韦和/或β-d-n4-羟基胞苷测定方法的问题，并且该方法可在灵敏度相对较差的仪器上常规使用，并且流动相简单、通用，可用于更多临床实验室开展患者体液样本尤其是血浆样本中莫诺拉韦和/或β-d-n4-羟基胞苷的浓度测定。
24、此外，本发明的方法不仅检测准确度高，而且莫诺拉韦/或其活性代谢物β-d-n4-羟基胞苷经衍生化后稳定性好。
1.一种基于苯甲酰氯化学衍生后液质联用测定人的体液中莫诺拉韦和/或其活性代谢物β-d-n4-羟基胞苷浓度的方法，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的基于苯甲酰氯化学衍生后液质联用测定人的体液中莫诺拉韦和/或其活性代谢物β-d-n4-羟基胞苷浓度的方法，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的基于苯甲酰氯化学衍生后液质联用测定人的体液中莫诺拉韦和/或其活性代谢物β-d-n4-羟基胞苷浓度的方法，其特征在于：
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的基于苯甲酰氯化学衍生后液质联用测定人的体液中莫诺拉韦和/或其活性代谢物β-d-n4-羟基胞苷浓度的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的基于苯甲酰氯化学衍生后液质联用测定人的体液中莫诺拉韦和/或其活性代谢物β-d-n4-羟基胞苷浓度的方法，其特征在于：
6.根据权利要求4所述的基于苯甲酰氯化学衍生后液质联用测定人的体液中莫诺拉韦和/或其活性代谢物β-d-n4-羟基胞苷浓度的方法，其特征在于：
7.根据权利要求6所述的基于苯甲酰氯化学衍生后液质联用测定人的体液中莫诺拉韦和/或其活性代谢物β-d-n4-羟基胞苷浓度的方法，其特征在于：
8.根据权利要求4所述的基于苯甲酰氯化学衍生后液质联用测定人的体液中莫诺拉韦和/或其活性代谢物β-d-n4-羟基胞苷浓度的方法，其特征在于：
9.根据权利要求4所述的基于苯甲酰氯化学衍生后液质联用测定人的体液中莫诺拉韦和/或其活性代谢物β-d-n4-羟基胞苷浓度的方法，其特征在于：
10.根据权利要求9所述的基于苯甲酰氯化学衍生后液质联用测定人的体液中莫诺拉韦和/或其活性代谢物β-d-n4-羟基胞苷浓度的方法，其特征在于：
