本发明属于芽孢诱导萌发领域，具体涉及一种芽孢诱导萌发剂及其在促进凝结海恩德里克斯氏菌芽孢萌发生长中的应用。
背景技术：
1、凝结海恩德里克斯氏菌（heyndrickxia coagulans）原名凝结芽胞杆菌（bacilluscoagulans），是一种兼具乳酸菌和芽孢杆菌双重功效的兼性厌氧革兰氏阳性菌，既能产乳酸又产芽孢，且与其他益生菌相比，具有更强的抗逆性、耐高温、胃酸和胆盐能力。研究表明凝结海恩德里克斯氏菌有调节肠道菌群、促进动物消化吸收、免疫调节等多种生理活性，被称作益生菌之王和动物生长促进剂，我国农业部于2013年将其正式列入《饲料添加剂品种目录》，作为抗生素替代品广泛应用于包括水产养殖、蛋鸡蛋鸭、肉鸡肉鸭与断奶仔猪的畜禽饲粮中。
2、凝结海恩德里克斯氏菌在外界环境适宜、营养丰富时进行营养繁殖；若遇极端条件或营养匮乏时则诱导芽孢产生。芽孢能够耐受饲料制粒工艺、胃液等极端条件，较营养细胞更易保存，是菌剂的主要应用形式，但菌剂只有在肠道内萌发为营养细胞时才能生长繁殖，产生代谢产物如 l-乳酸、凝固素等物质发挥益生菌活性。凝结海恩德里克斯氏菌在胃肠道的存活率很高，但肠道内芽孢萌发率却低于10%。研究表明，凝结海恩德里克斯氏菌芽孢在萌发剂(agfk)、d-果糖、l-天冬酰胺等芽孢杆菌属常用的萌发因子作用下，萌发率低于70%。因此寻找一种有效的萌发剂提高凝结海恩德里克斯氏菌的萌发率对其生产应用中最大限度地发挥益生菌功效具有重要意义。
技术实现思路
1、针对凝结海恩德里克斯氏菌芽孢萌发率低的问题，本发明提供了一种芽孢诱导萌发剂及其在促进凝结海恩德里克斯氏菌芽孢萌发生长中的应用。
2、本发明芽孢诱导萌发剂，包括如下组分：
3、d-葡萄糖30-100mmol/l，海藻糖30-100 mmol/l，l-丙氨酸50-100 mmol/l，肌苷50-100 mmol/l，ca2+-dpa30-100 mmol/l（30-100 mmol/l cacl2，30-100 mmol/l dpa）。
4、所述芽孢诱导萌发剂以10 mmol/l tris-hcl和10 mmol/l nacl作为复配溶剂。
5、本发明芽孢诱导萌发剂在促进凝结海恩德里克斯氏菌芽孢萌发生长中的应用。
6、包括以下步骤：
7、步骤1：芽孢的收集和纯化
8、1-1、将凝结海恩德里克斯氏菌在bc固体培养基上划线，40℃培养24小时后挑取单菌落转移至bc液体培养基中，并在40℃，180 r/min条件下振荡培养12小时。
9、1-2、以1-5%的接种量将凝结海恩德里克斯氏菌菌液转接到产孢培养基中，40℃，180 r/min条件下振荡培养24小时后厌氧培养48小时。当芽孢转化率达到95%以上时，于4℃，8000 r/min离心10 min收集芽孢。
10、通过孔雀石绿染色法评价芽孢转化率，具体方法是滴加一滴无菌水于洁净载玻片上，挑菌涂布，干燥，经火焰来回20次热固定，饱和孔雀石绿室温下覆盖染色15min以上，水洗，石炭酸复红染液覆盖1~2min，水洗，干燥后显微镜观察。
11、1-3、为了获得100%纯度的芽孢，将芽孢悬液浸于80℃水浴15分钟，以去除营养体和正在萌发的细胞，为了有效去除培养基残渣和细胞碎片，用预冷的灭菌后的超纯水反复洗三次来纯化芽孢。将纯化的芽孢调节浓度至 108 cfu/ml，4℃保存备用。
12、步骤2：芽孢萌发
13、用灭菌水将芽孢悬浮液吸光度调至od600nm≈1.0，转移至60-75℃水浴10-20min后冷却至室温，8000 r/min离心2 min后加入所述芽孢诱导萌发剂（体积1ml：1ml），转移至培养箱，于40-45℃、150-200 r/min振荡培养1-3h。检测芽孢悬浮液在600 nm时的吸光值，检测前将试管摇动至少30s，使芽孢均匀分布。
14、本发明操作简单易行，关键技术在于孢子萌发剂的制备、水浴热激活以及孢子萌发，使凝结海恩德里克斯氏菌的芽孢萌发率提高到95%，为凝结海恩德里克斯氏菌的萌发及萌发后发挥益生功效提供理论基础。本发明中的萌发剂可用于畜禽养殖、水产养殖中促进凝结海恩德里克斯氏菌芽孢的快速萌发，有效发挥益生菌功效。
1.一种芽孢诱导萌发剂，其特征在于包括如下组分：
2.根据权利要求1所述的芽孢诱导萌发剂，其特征在于：
3.根据权利要求1或2所述的芽孢诱导萌发剂，其特征在于包括如下组分：
4.权利要求1或2所述芽孢诱导萌发剂在促进凝结海恩德里克斯氏菌芽孢萌发生长中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：
