本发明涉及一种色谱分析柱用微型前置滤器，特别涉及一种高效液相色谱柱用微型前置滤器，属于高效液相色谱分析领域。
背景技术：
1、高效液相色谱法(hplc)是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法，其在医学检测中有着广泛的应用，可用于常见的生物标志物检测，如葡萄糖含量、糖化血红蛋白、尿酸含量和血清脂质含量等等，这些项目在疾病的确诊、治疗方案的制定、疾病预后估计等方面具有重要的临床应用价值。
2、hplc原理是利用不同物质在色谱柱上的吸附和洗脱行为差异进行分离和检测，色谱柱的性能与检测系统性能密切相关。对于hplc，样品和流动相中含有的固体颗粒物质会堵塞色谱柱筛板，从而引起色谱柱柱压升高，柱效下降。为保护色谱柱，延长其使用寿命，hplc检测系统采用柱前过滤器，但其价格昂贵，增加检测成本。
3、临床实践中发现，现有的采用柱前过滤器(即hplc检测系统的柱前过滤器)的全自动糖化血红蛋白分析仪在仪器停止检测一段时间后，重新检测样品时，前面的1-2个标本的糖化血红蛋白检测结果会出现升高或降低的情况(临床检测中发现有这种情况，考虑与过滤器滤膜及滤膜过滤稳定性有关)，导致检测结果不准确，影响结果判定。因此，有必要开发一种全新的微型前置滤器，以减少测定偏差和延长色谱柱的寿命。
4、现有的采用表面滤膜和单一过滤结构的hplc前置滤器容易发生堵塞，使用次数较少。当大小不一的颗粒物质同时聚集于表面滤膜时，由于发生堵塞效应(plug effect)更容易导致微型前置滤器的堵塞。而使用深度滤膜，并根据颗粒的大小逐级过滤，可延长微型前置滤器的使用次数，保持过滤效果，最大限度地保护色谱柱。因此，逐级过滤设计适用于新型微型前置滤器的研发。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种高效液相色谱柱用微型前置滤器、制备方法及其应用。本发明的微型前置滤器采用三级过滤设计，明显降低了堵塞效应，有效的保护了hplc色谱柱的分离能力和柱效，延长了色谱柱的使用寿命。
2、为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种高效液相色谱柱用微型前置滤器，包括：呈圆柱、中空的柱壳体，以及安装在柱壳体内部的三级过滤组件即采用三级过滤设计，其中第一级过滤采用大孔径滤纸，第二级过滤采用大孔径滤膜，第三级过滤采用小孔径滤膜。
3、特别是，所述的三级过滤设计所使用的滤材为亲水性深度滤材，包括亲水滤纸和亲水滤膜，同时该滤材具有低蛋白吸附特征。
4、特别是，过滤组件包括从微型前置滤器进液端至出液端依次放置的第一、第二、第三滤层；所述第一滤层由2层叠合在一起的滤纸制成；第二、第三滤层分别由1层滤膜制成；其中第二滤层的滤膜孔径大于第三滤层的滤膜孔径。
5、特别是，还包括对微型前置滤器建立了性能评估程序，通过评估不同滤材和孔径的微型前置滤器对检测性能(精密度和携带污染)及色谱柱的影响(保留时间、色谱柱柱效及色谱柱使用次数)，以优化微型前置滤器的滤膜材质和孔径。
6、在本发明中，所述第一滤层为玻璃纤维滤纸、复合纤维素滤纸和高分子聚合滤纸的一种或多种，所用滤纸孔径为0.22～2.70μm，厚度为0.30～0.40mm，通过固定第二和第三滤层滤材，改变第一滤层滤材制备不同的微型前置滤器，用于hplc法糖化血红蛋白(hba1c)的检测，根据对检测精密度和携带污染的评估，进一步优选地，所述的玻璃纤维滤纸，孔径为2.70μm。
7、所述第三滤层使用的亲水性深度滤膜为聚醚砜滤膜(pes滤膜)、混合纤维素膜(mce滤膜)、亲水聚四氟乙烯膜(ptfe滤膜)或过氯乙烯滤膜(pvc滤膜)、硝酸纤维素滤膜(nc滤膜)、聚偏二氟乙烯滤膜(pvdf滤膜)的一种或多种，滤膜的孔径为0.22或0.45或0.80μm，厚度为0.30～0.40mm，根据对hba1c检测精密度和携带污染的评估，以及对色谱柱保留时间、色谱柱柱效和色谱柱使用次数的影响，进一步优选地，所述的mce滤膜、亲水ptfe滤膜和pes滤膜，滤膜孔径为0.22μm。
8、本发明再一方面提供一种高效液相色谱柱用微型前置滤器的制备方法，包括：
9、1)将滤材裁切成圆片，直径与柱壳体的内径相匹配；
10、2)在柱壳体的内部从进液端到出液端顺序依次放置第一滤层、第二滤层、第三滤层、金属网；
11、3)将柱壳体扣合，密封，即制得所述的微型前置滤器。
12、本发明的高效液相色谱柱用微型前置滤器，其结构采用三级过滤设计，其主要设计为第一滤层(一级过滤)采用大孔径滤纸，第二滤层(二级过滤)采用大孔径滤膜，第三滤层(末级过滤)采用小孔径滤膜。三级过滤设计所使用的滤材均为亲水性深度滤材，同时该滤材具有低蛋白吸附特征。微型前置滤器的制备第一滤层采用2层滤纸，第二滤层采用1层大孔径滤膜，第三滤层采用1层小孔径滤膜。一级过滤从流动相中去除细胞、细胞膜、细胞碎片或颗粒物质，二级过滤用于去除溶血过程中产生的脂肪、磷脂、脂质等聚合物颗粒，末级过滤用于从流动相中过滤小颗粒的表面活化聚合物、小分子血清蛋白、脂肪和膜磷脂等，最大限度的保护色谱柱的分离能力和柱效，并延长色谱柱使用寿命。
13、本发明的高效液相色谱柱用微型前置滤器在高效液相色谱分析检测中的应用；该前置滤器置于色谱柱的前端，以保护色谱柱的柱效和分离能力；亦可用于高效液相色谱串联质谱分析领域。
14、本发明另一方面提供一种高效液相色谱柱用微型前置滤器，包括：呈圆柱体型的、内部中空的柱壳体，以及固定安装在柱壳体内部的用于分级过滤的过滤组件和支撑过滤组件的金属网。
15、其中，所述过滤组件包括第一、第二、第三滤层，并且第一、第二、第三滤层叠加在所述金属网的上面，金属网的上面依次为第三滤层、第二滤层、第一滤层。
16、特别是，过滤组件的滤材为亲水性深度滤材，包括亲水性滤纸和或滤膜。
17、特别是，所述第一滤层由2层叠合在一起的滤纸制成；第二、第三滤层分别由1层滤膜制成；其中第二滤层的滤膜的孔径大于第三滤层的滤膜孔径。
18、特别是，所述滤纸为玻璃纤维滤纸、复合纤维滤纸或高分子聚合滤纸，优选为玻璃纤维滤纸；第二滤层滤膜为聚醚砜滤膜(pes滤膜)、混合纤维素膜(mce滤膜)、亲水聚四氟乙烯膜(ptfe滤膜)或过氯乙烯滤膜(pvc滤膜)、硝酸纤维素滤膜(nc滤膜)、聚偏二氟乙烯滤膜(pvdf滤膜)，优选为聚醚砜滤膜(pes滤膜)；第三滤层滤膜为聚醚砜滤膜(pes滤膜)、混合纤维素膜(mce滤膜)、亲水聚四氟乙烯膜(ptfe滤膜)或过氯乙烯滤膜(pvc滤膜)、硝酸纤维素滤膜(nc滤膜)、聚偏二氟乙烯滤膜(pvdf滤膜)，优选为聚醚砜滤膜(pes滤膜)、混合纤维素膜(mce滤膜)或亲水聚四氟乙烯膜(ptfe滤膜)。
19、特别是，所述第一滤层的滤纸孔径为0.22～2.70μm，优选为2.70μm；厚度为0.30～0.40mm；第二滤层的滤膜的孔径为0.22～0.80μm，优选为0.80μm；厚度为0.10～0.20mm；第三滤层的滤膜的孔径为0.22～0.80μm，优选为0.22或0.45或0.80μm，进一步优选为0.22μm；厚度为0.1～0.2mm。
20、特别是，第一滤层滤纸材质、孔径按照如下方法筛选获得：将以不同的材质/孔径的第一滤层的微型前置滤器与高效液相色谱柱联用，通过测定全血标本中hba1c浓度，评估不同的第一滤层材料对hba1c浓度检测的精密度和携带污染，选择精密度小于1％；携带污染率小于0.5％的滤材。
21、特别是，微型前置滤器的第二滤层为孔径为0.80μm的pes滤膜；第三滤层为0.45μm的mce滤膜。
22、特别是，第三滤层滤膜的材质、孔径按照如下方法筛选获得：将以不同的材质/孔径的第三滤层的微型前置滤器与高效液相色谱柱联用，通过测定全血标本中hba1c浓度，评估不同的第三滤层材料对hba1c浓度检测的精密度和携带污染，选择精密度小于1％；携带污染率小于0.5％的滤材。
23、即筛选变异系数小于1％的滤材。
24、特别是，微型前置滤器的第一滤层为玻璃纤维滤纸；第二滤层为孔径为0.80μm的pes滤膜。
25、特别是，所述第一滤层过滤去除流动相中的细胞、细胞膜、细胞碎片或颗粒物质；第二滤层过滤去除流动相中的脂肪、磷脂、脂质等聚合物颗粒；第三滤层过滤去除流动相中的小颗粒的表面活化聚合物、小分子血清蛋白、脂肪和膜磷脂。
26、特别是，所述金属网为镍网或不锈钢网，起支撑和分配液流的作用。
27、特别是，所述金属网的孔径为100.0～400.0目，优选为200目；厚度为0.1～0.5mm，优选为0.3mm。
28、特别是，所述柱壳体选用耐高压、耐腐蚀的聚碳酸酯(pc)材料、聚乙烯(pe)材料、特氟龙材料中的一种或多种制成。
29、特别是，所述柱壳体包括柱本体和封闭柱本体上下底面的上盖和下盖，其中上盖、下盖为圆形，其直径与柱本体直径相匹配。
30、特别是，所述柱本体为内部中空的圆柱体；所述上盖与柱本体呈一体连接。
31、特别是，上盖的中央位置(圆心位置)设在进液口，进液口与进液管密封连接；下盖的中央位置(圆心位置)设在出液口，出液口与出液管密封连接。
32、特别是，过滤组件呈圆形，与柱本体的上下底面的形状相同，即第一、第二、第三滤层、金属网为圆形结构，直径与柱本体的内径相匹配。
33、本发明另一方面，提供一种如上所述的高效液相色谱柱用微型前置滤器的制备方法，包括如下步骤：
34、1)将第一滤层的滤纸、第二、第三滤层的滤膜裁切成圆片，直径与柱壳体的内径相匹配；
35、2)将金属网裁切成圆片，直径与柱壳体的内径相匹配；
36、3)在柱壳体的内部从靠近上盖至下盖的顺序依次放置第一滤层、第二滤层、第三滤层、金属网；
37、4)在柱壳体的靠近金属网的一端扣合下盖，在另一端扣合上盖，即制得所述的微型前置滤器。
38、本发明又一方面提供一种如上所述的高效液相色谱柱用微型前置滤器在高效液相色谱分析检测中的应用。
39、本发明又一方面提供一种如上所述的高效液相色谱柱用微型前置滤器在糖化血红蛋白、血红蛋白变异体的高效液相色谱分析检测中的应用。
40、发明的微型前置滤器为应用于高效液相色谱检测领域中色谱柱的微型前置滤器，以保护色谱柱的柱效和分离能力，主要应用于高效液相色谱法糖化血红蛋白的检测。
41、本发明的微型前置滤器置于高效液相色谱柱的前端，以实现色谱柱的保护。本发明的微型前置滤器还可用于高效液相色谱串联质谱分析领域。
42、与现有技术相比，本发明优点在于：
43、1.本发明的微型前置滤器采用多级过滤的设计，避免了采用单一过滤结构的微型前置滤器容易发生堵塞的缺点(因为当大小不一的颗粒物质同时聚集于同一滤膜表面，进行过滤时，由于发生堵塞效应更容易导致微型前置滤器的堵塞)，以减少聚集性堵塞发生，本发明的三级过滤结构设计可增加微型前置滤器的使用次数；
44、2.本发明的微型前置滤器采用亲水性深度滤材，对比表面滤材可实现高浓度颗粒物的过滤；
45、3.本发明的微型前置滤器最大限度的保护色谱柱的分离能力和柱效，并延长色谱柱使用寿命；
46、4.相比较大孔径深度滤材，小孔径滤材展示了更优的性能。
47、5.本发明的微型前置滤器制备工艺简单，生产成本低，色谱柱保护效能好，满足临床血液样本处理的应用需求，显著降低高效液相色谱法高值耗材的使用成本。
1.一种高效液相色谱柱用微型前置滤器，其特征是，包括：呈圆柱中空的柱壳体，以及安装在柱壳体内部的三级过滤组件即采用三级过滤设计，其中第一级过滤采用大孔径滤纸，第二级过滤采用大孔径滤膜，第三级过滤采用小孔径滤膜。
2.如权利要求1所述的微型前置滤器，其特征是，所述的滤材为亲水性深度滤材，包括亲水滤纸和滤膜，同时所述滤材具有低蛋白吸附特征。
3.如权利要求1或2所述的微型前置滤器，其特征是，所述过滤组件包括从微型前置滤器进液端至出液端依次放置的第一、第二、第三滤层；所述第一滤层由2层叠合在一起的滤纸制成；第二、第三滤层分别由1层滤膜制成；其中第二滤层的滤膜孔径大于第三滤层的滤膜孔径。
4.如权利要求3所述的微型前置滤器，其特征是，所述滤纸为玻璃纤维滤纸、复合纤维滤纸或高分子聚合滤纸；第二滤层滤膜为聚醚砜滤膜、混合纤维素膜、亲水聚四氟乙烯膜或过氯乙烯滤膜，优选为聚醚砜滤膜；第三滤层滤膜为聚醚砜滤膜、混合纤维素膜、亲水聚四氟乙烯膜、过氯乙烯滤膜、硝酸纤维素滤膜或聚偏二氟乙烯滤膜，优选为聚醚砜滤膜、混合纤维素膜或亲水聚四氟乙烯膜。
5.如权利要求3所述的微型前置滤器，其特征是，所述第一滤层的滤纸孔径为0.22～2.70μm，优选为2.70μm；厚度为0.30～0.40mm；第二滤层的滤膜孔径为0.22～0.80μm，优选为0.80μm；厚度为0.10～0.20mm；第三滤层的滤膜孔径为0.22～0.80μm，优选为0.22或0.45或0.80μm，进一步优选为0.22μm；厚度为0.1～0.2mm。
6.如权利要求2所述的微型前置滤器，其特征是，所述第一滤层过滤去除流动相中的细胞、细胞膜、细胞碎片或颗粒物质；第二滤层过滤去除流动相中的脂肪、磷脂、脂质等聚合物颗粒；第三滤层过滤去除流动相中小颗粒的表面活化聚合物、小分子血清蛋白、脂肪和膜磷脂。
7.如权利要求1所述的微型前置滤器，其特征是，所述金属网为镍网或不锈钢网，起支撑和分配液流的作用。
8.如权利要求1所述的微型前置滤器，其特征是，还包括对微型前置滤器建立了性能评估程序，通过评估不同材料和孔径的前置滤器对色谱柱的影响(保留时间、色谱柱柱效及色谱柱使用次数)，以优化微型前置滤器的滤膜材质和孔径。
9.一种如权利要求1-8任一所述高效液相色谱柱用微型前置滤器的制备方法，其特征是，包括如下步骤：
10.如权利要求1-8任一所述的高效液相色谱柱用微型前置滤器在高效液相色谱分析检测中的应用；该前置滤器置于色谱柱的前端，以实现对色谱柱的保护。本专利发明，亦可用于高效液相色谱串联质谱分析领域。
