本发明涉及基因工程，具体涉及一种融合蛋白ksa-sspcas9及其突变体在基因编辑中的应用。
背景技术：
1、crispr/cas9系统(clustered regularly interspaced palindromic repeats/crispr-associated proteins system)，是由来自古生菌和细菌的天然免疫系统，为细菌和古生菌抵御外源病毒或质粒入侵。其作用原理是：当病毒入侵某些细菌时，细菌能把病毒的一小段基因整合到自身dna中，当病毒再次入侵时，细菌能识别出病毒基因，并切割其基因以沉默表达，以达到抵抗病毒的作用。
2、crispr/cas9系统发挥功能的三个阶段主要包括适应阶段(adaptation)、表达和成熟阶段(expression)和干扰阶段(interference)。适应阶段，细菌通过特定的cas蛋白识别入侵核酸中的pam序列，并将紧邻这pam序列的dna片段整合到自身的crispr序列中；表达和成熟阶段，crispr阵列被转录成pre-crrna，pre-crrna进一步被加工为成熟的crrna，crrna序列与外源dna片段互补，同时cas蛋白表达；干扰阶段，crrna与cas9蛋白形成核糖核蛋白复合体(rnp)，crrna-cas9复合体识别并结合到目标dna的pam位点，cas9蛋白对目标dna进行切割产生dbs，dbs触发细胞中的修复机制，非同源末端连接(non-homologous end-joining，nhej)和同源重组(homologous
3、recombination，hr)。nhej修复的结果会引起碱基的缺失或插入，可以进行基因敲除；在提供同源模板的情况下，利用hr修复可以进行基因的定点插入和碱基的精确替换。
4、作为第三代编辑工具，与第一代zfns和第二代talens相比，具有设计更简单、编辑效率更高和应用范围更广等优点，成为当今最主流的基因编辑系统，其中应用最为广泛的是ii型crispr/cas基因编辑系统，现有技术中源自化脓链球菌(streptococcus pyogene，spcas9)和金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus，sacas9)的ii型系统切割效率较高。但sacas9(1053个氨基酸残基)明显小于spcas9(1368个氨基酸残基)，因此更容易传递到体细胞组织进行基因组编辑。此外，cas9需要识别特定的pam，其中spcas9识别ngg的pam，sacas9识别nngrrt的pam，pam识别的特异性也限制了cas9的应用。因此，基于现有的ii型crispr/cas9系统，急需开发新的编辑能力更强，分子量更小的crispr/cas基因编辑系统。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题为：提供一种编辑能力更强的cas蛋白及crispr/cas基因编辑系统。
2、本发明的技术方案为：一种融合蛋白ksa-sspcas9，其氨基酸序列如seq id no.3所示。
3、编码上述所述的融合蛋白ksa-sspcas9的基因。
4、一种融合蛋白ksa-sspcas9的突变体，其氨基酸序列如seq id no.4所示。
5、编码上述所述的突变体的基因。
6、一种载体，含有编码融合蛋白ksa-sspcas9或突变体的基因。
7、一种细胞，含有上述所述的载体。
8、上述所述的融合蛋白ksa-sspcas9或突变体或seq id no.1所示氨基酸序列的蛋白sspcas9在crispr-cas9基因编辑系统中的应用。
9、进一步地，所述crispr-cas9基因编辑系统为单碱基编辑器。
10、一种缀合物，所述缀合物含有上述所述的融合蛋白ksa-sspcas9或突变体或seqidno.1所示氨基酸序列的蛋白sspcas9。
11、上述所述的缀合物还可以包括a)修饰部分；例如，所述修饰部分选自另外的蛋白或多肽、可检测标记或其组合；例如，所述另外的蛋白或多肽选自胞嘧啶脱氨酶(cbe)、腺嘌呤脱氨酶(abe)、胞嘧啶甲基转移酶dnmt3a和mq1、胞嘧啶去甲基化酶tet1、转录激活蛋白vp64、p65和rta以及转录抑制蛋白krab中的一种或者多种；或/和b)任选的用于连接cas9蛋白与所述修饰部分的接头或非共价偶联系统；例如，所述接头为长度为1-50个氨基酸的接头；所述非共价偶联系统包括基于ms2、pp7、boxb等rna/多肽相互作用系统以及基于gcn4/scfv等多肽/多肽相互作用系统。
12、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
13、(1)本发明的一种ii型crispr/cas9基因编辑系统，其分子量较spcas9(1368个氨基酸残基)更小，为1052个氨基酸残基；同时本发明的ii型crispr/cas9基因编辑系统可以识别特定的nng pam序列，极大的增加了可靶向的范围，克服了spcas9的局限性。
14、(2)本发明的的ksa-sspcas9融合蛋白及其变体，在碱基编辑方面比sspcas9具有更强的编辑效率，同时sa-sspcas9-kkh变体识别更广的nnn的pam序列，且对nrn具有比nyn更高的编辑效率。
15、(3)采用本发明cas9蛋白的ii型crispr/cas9及其变体碱基编辑器能够在sgrna的引导下，在哺乳动物细胞行使基因编辑功能。本发明cas9蛋白及其变体基因编辑系统的发现扩大了基因编辑工具的种类，对推动基因治疗在临床中的应用具有重要作用。
1.一种融合蛋白ksa-sspcas9，其氨基酸序列如seq id no.3所示。
2.编码权利要求1所述的融合蛋白ksa-sspcas9的基因。
3.一种融合蛋白ksa-sspcas9的突变体，其氨基酸序列如seq id no.4所示。
4.编码权利要求3所述的突变体的基因。
5.一种载体，含有权利要求2或权利要求4所述的基因。
6.一种细胞，含有权利要求5所述的载体。
7.权利要求1所述的融合蛋白ksa-sspcas9或权利要求3所述的突变体或seq id no.1所示氨基酸序列的蛋白sspcas9在crispr-cas9基因编辑系统中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述crispr-cas9基因编辑系统为单碱基编辑器。
9.一种缀合物，其特征在于，所述缀合物含有权利要求1所述的融合蛋白ksa-sspcas9或权利要求3所述的突变体或seq id no.1所示氨基酸序列的蛋白sspcas9。
