本发明属于分析化学检测，具体涉及谷胱甘肽(gsh)响应以检测早期生长反应因子-1(egr-1)mrna和沉默其表达的一种多功能的三角dna生物传感器的构建及应用。
背景技术：
1、目前，恶性肿瘤是危害人类健康的难治性疾病，其原因是常规化疗选择性低、细胞耐药性高，对健康组织产生副作用，肿瘤复发/转移等。肿瘤微环境(tme)对于肿瘤的发生和发展至关重要，因此，充分利用肿瘤微环境对于提高检测肿瘤标志物的准确性和治疗癌症具有重要意义。
2、谷胱甘肽(gsh)作为一种非蛋白硫醇，通过消除活性氧(ros)在维持生物系统中的氧化还原稳态中起着不可替代的作用。癌细胞具有更高丰度水平的ros，以增强对有氧糖酵解的需求，这在逻辑上导致gsh含量更高，从而保护细胞免受ros诱导的细胞凋亡。而且，在大多数研究中谷胱甘肽用来切断二硫键。早期生长反应-1(egr-1)，作为一种多结构域蛋白，与几个重要的生理过程有关，包括发育、代谢、细胞生长和增殖。egr-1是一种抗癌基因，可监测dna损伤保守，促进肿瘤细胞凋亡，佐剂可提高放化疗的抗癌效率。然而，在恶劣环境下，egr-1表达水平升高，以维持肿瘤细胞的存活、增殖、转移和血管生成作为致癌基因。识别和利用egr-1在癌症中的“敌人”作用，可以为恶性肿瘤患者的基因治疗打开视野。因此，在本发明中，dnazyme、ss-l和apt-dna三条功能dna单链形成一种多功能的三角dna生物传感器，dnazyme中的fam的荧光被apt-dna中的bhq1猝灭导致低的背景信号。设计的多功能的三角dna生物传感器采用apt-dna精准靶向癌细胞，同时gsh响应对目标物egr-1进行高选择性和高灵敏度检测和基因沉默，该传感器也表现出优异的酶稳定性和时间稳定性，这对于肿瘤内的精准识别标志物和癌症的治疗具有重要的意义和一定的实用价值。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种多功能的三角dna生物传感器的制备方法，该生物传感器包含靶向癌细胞的是适配体以精准识别癌细胞，还可以实现肿瘤细胞内谷胱甘肽(gsh)响应以检测早期生长反应因子-1(egr-1)mrna和沉默其表达。
2、本发明的目的通过如下技术方案实现。
3、一种多功能的三角dna生物传感器的构建及应用，其特在于以下合成步骤：
4、dnazyme(10μl，20μm)、ss-l和apt-dna(20μl，20μm)与150μlpbs缓冲液混合均匀，一锅法在37℃孵育20min以得到多功能的三角dna探针(命名为tsdz)。
5、本发明的工作原理为：
6、(1)多功能的三角dna生物传感器由三条功能dna单链组成，分别为dnazyme、ss-l和apt-dna。
7、(2)在没有gsh和目标物egr-1mrna的情况下，修饰在dnazyme的5’端上的fam和apt-dna上3’端的bhq1接近，导致fam的荧光被bhq1猝灭，产生较低的背景信号。
8、(3)在只有gsh存在时，ss-l中的二硫键被gsh还原而断裂，但没有目标物egr-1mrna，tsdz上的dnazyme不会与目标物结合产生荧光。
9、(4)在只有目标物egr-1mrna存在，而无gsh存在的情况下，egr-1mrna会与tsdz上5’端部分结合导致少量荧光回升。
10、(5)在gsh和目标物egr-1mrna同时存在时，gsh切割二硫键释放出部分结合位点，在目标物egr-1mrna的作用下可以将tsdz上的dnazyme置换下来产生大量荧光，同时，在镁离子的作用下会对egr-1mrna进行切割以基因沉默。
11、dnazyme、ss-l和apt-dna的序列为：
12、dnazyme：5’-aaccgcggccaggctagctacaacgacctggacga-3’；
13、ss-l：5’-tagtgtatatgcgttttcgtc/ihs-sh/caggtcgttgtttccgcggtttttcgtatctcagagga-3’；
14、apt-dna：5’-acgcatatacactacgcagttgatcctttggataccctggtc ctctgagatacga-3’。
15、本发明设计得谷胱甘肽(gsh)响应以检测早期生长反应因子-1(egr-1)mrna和沉默其表达。
16、荧光的检测条件设置为：激发波长：488nm，激发狭缝：5nm，发射狭缝：5nm，电压：800v。
1.一种多功能的三角dna生物传感器的构建及应用，其特在于以下合成步骤：dnazyme(10μl，20μm)、ss-l和apt-dna(20μl，20μm)与150μlpbs缓冲液混合均匀，一锅法在37℃孵育20min以得到多功能的三角dna探针(命名为tsdz)。
2.根据权利要求1所述的一种多功能的三角dna生物传感器的构建及应用，其特在于：
3.根据权利要求1所述的一种多功能的三角dna生物传感器的构建及应用，其特在于dnazyme、ss-l和apt-dna的序列：
4.根据权利要求1所述的一种多功能的三角dna生物传感器的构建及应用，其特在于，该生物传感器通过谷胱甘肽(gsh)响应以检测egr-1mrna和沉默其表达，具有高的灵敏度和检测速度。
5.根据权利要求1所述的一种多功能的三角dna生物传感器的构建及应用，其特在于荧光的检测条件设置为：
