本发明属于基因工程，尤其是一种高效生产epa的裂殖壶菌基因工程菌株、方法和应用。
背景技术：
1、二十碳五烯酸(epa)是一种ω-3型长链多不饱和脂肪酸(lc-pufa)，是人类和动物营养中的重要营养素，与健康息息相关。研究表明，ω-3lc-pufa的摄入对炎症、改善血浆脂质和认知功能有多种有益的影响，并且摄入的多不饱和脂肪酸中epa和二十二碳六烯酸(dha)的比例对它们的功能有很大程度的影响。目前，市面上富含ω-3lc-pufa的产品一般是从深海鱼中提取的鱼油，作为保健品或膳食补充剂售卖，但鱼油资源的短缺和不可持续限制了ω-3lc-pufa产品的生产销售，无法满足日益增长的市场需求，这表明需要寻找新的可持续资源。
2、裂殖壶菌是一株富含脂质的异养海洋原生生物，具有强大的多不饱和脂肪酸合成和储存能力，富含dha且占总脂质的35-40％，被广泛应用于含dha的油脂的工业生产。相对于鱼油提纯，裂殖壶菌发酵生产脂质减少对海洋资源的依赖，通过育种、基因编辑和发酵、提纯工艺优化，可以降低生产成本，绿色可持续生产高质量功能性脂肪酸。作为具有潜力的产油微生物，裂殖壶菌已被用于量产dha，但裂殖壶菌中天然epa占总脂肪酸(tfas)含量的占比甚至不足1％，而常规的发酵工程方法无法从根源上弥补裂殖壶菌epa合成能力的不足。因此，裂殖壶菌发酵生产epa的关键在于基因工程改造从而获得高效生产epa的工程菌株。
3、在裂殖壶菌hx-308中，lc-pufa的合成主要依赖pks途径，不同宿主来源的pks途径因各个相似结构域中的细微差异导致最终产物的占比不同，一些海洋原核细菌中的pks被鉴定为具有特异性生产二十碳五烯酸的能力，主要通过其pks途径中的酮酰基合酶(ks)和脱水酶(dh)功能域决定其最终产物的链长和不饱和键位置。通过对这些关键催化结构域的有效鉴定和对裂殖壶菌中相应功能域的改造，有助于改变裂殖壶菌中脂质成分，提高高价值多不饱和脂肪酸二十碳五烯酸的产量。
技术实现思路
1、本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种高效生产epa的裂殖壶菌基因工程菌株、方法和应用。
2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
3、一种高效生产epa的裂殖壶菌基因工程菌株，所述基因工程菌株是通过将裂殖壶菌pks途径中关键催化结构域orfa、orfb-ksb/clf替换为异源epa型pks途径中对应功能域得到的，该基因工程菌株能够改善基因工程菌株中的多不饱和脂肪酸，尤其是二十碳五烯酸的占比。
4、进一步地，所述基因工程菌株为替换pks中关键基因酮酰基合酶ksa所在的orfa亚基为photobacteriumprofundum中ksa功能域所在的pfaa亚基的裂殖壶菌基因工程菌株，所述菌株是以产油schizochytrium sp.hx-308为出发菌株构建而成，所述菌株含有来源于photobacteriumprofundum的pfaa功能域，用于替换schizochytrium sp.hx-308内源存在的orfa功能域，以提高裂殖壶菌hx-308中的epa的百分含量；
5、所述pfaa基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
6、进一步地，所述基因工程菌株为替换pks中orfb亚基上关键基因酮酰基合酶ksb/clf为photobacteriumprofundum中ksc/clf和脱水酶dhfaba功能域所在的pfac亚基的裂殖壶菌基因工程菌株，所述菌株是以产油schizochytrium sp.hx-308为出发菌株构建而成，所述菌株含有来源于photobacterium profundum的pfac功能域，用于替换schizochytriumsp.hx-308内源存在的orfb功能域上的ksb/clf基因，以提高裂殖壶菌hx-308中的epa的百分含量；
7、所述pfac基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
8、进一步地，所述裂殖壶菌基因工程菌株经发酵后产生的epa分别达到总油脂含量的4.24％和10.19％，epa含量分别提高了2.52和7.47倍。
9、如上所述的基因工程菌株的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
10、(1)克隆来源于schizochytrium sp.hx-308的orfa亚基基因上游和下游片段，以及photobacteriumprofundum中的pfaa亚基基因，通过一步克隆技术将上述基因插入pbs-zeo质粒中，构建替换载体pbs-zeo-orfa::pfaa；
11、(2)将上述的替换载体pbs-zeo-orfa::pfaa线性化后电转导入schizochytriumsp.hx-308，获得替换photobacteriumprofundum中pfaa亚基基因的裂殖壶菌基因工程菌株；
12、或者，包括如下步骤：
13、(1)克隆来源于schizochytrium sp.hx-308的orfb亚基上的酮酰基合酶ksb/clf基因的上游和下游片段，以及photobacteriumprofundum中的酮酰基合酶ksc/clf基因和脱水酶dhfaba基因所在的pfac亚基基因，通过一步克隆技术将上述基因插入pbs-zeo质粒中，构建替换载体pbs-zeo-ksb/clf::pfac；
14、(2)将上述的替换载体pbs-zeo-ksb/clf::pfac线性化后电转导入schizochytrium sp.hx-308，获得替换photobacteriumprofundum中pfac亚基基因的裂殖壶菌基因工程菌株。
15、如上所述的基因工程菌株在生产epa中的应用。
16、一种利用如上所述的基因工程菌株定向生产epa的方法，将所述基因工程菌株接种于种子培养基活化培养后，获得发酵种子菌种；将所述发酵种子菌种接种于发酵培养基中进行发酵培养，收集菌体、提取脂质，得到epa。
17、进一步地，具体步骤如下：
18、首先，将所述基因工程菌株从平板培养基接种至种子培养基，并连续两次转接培养，分别获得一级种子液和二级、三级种子液，最后得到的三级种子液即作为上述发酵所用种子菌种；其中，所述种子液培养的条件为25～30℃，160～200r/min于培养箱中振摇培养20-30h；
19、其次，所述收集菌体和脂质提取的方法包括：
20、1)发酵结束后的发酵液中加入naoh溶液调整ph至10-12后，加入适量0.1-0.5％(w/v)的破壁酶，于50-60℃，100-200rpm条件下反应6-12h；
21、2)加入等体积无水乙醇并持续振荡1h，使破壁酶失活；
22、3)加入无水乙醇相同体积的正己烷并持续振荡1h，萃取发酵液中的脂质，待振荡完毕后室温静置至分层，收集上层有机相；
23、4)重复步骤3)若干次并合并收集的有机相，通过旋蒸使正己烷挥发，得到油脂。
24、进一步地，具体步骤如下：
25、(1)发酵种子培养：将所述基因工程菌株接种于平板培养基经抗性平板培养后，将所述基因工程菌株后，挑去单菌落接种于50ml种子培养基中，28℃，180r/min摇床培养24h后为一级种子；取每1ml一级种子培养液接种于50ml种子培养基中，28℃，180r/min摇床培养24h为二级种子；取每1ml二级种子培养液接种于50ml种子培养基中，28℃，180r/min摇床培养24h为三级种子，作为发酵用菌种；
26、(2)摇瓶发酵培养：取每10ml三级种子培养液接种于90ml发酵培养基中，28℃，180r/min摇床培养120h；
27、(3)收集菌体提取脂质，包括以下步骤：
28、1)向发酵培养结束后的发酵液中加入naoh溶液调ph 10-12后，加入在发酵液中质量终浓度为0.1-0.5％的破壁酶，50～60℃，100～200r/min振荡6～12h；
29、2)冷却至室温，加入与添加破壁酶后发酵液等体积的无水乙醇振荡1h以失活破壁酶；
30、3)加入与无水乙醇体积相同的正己烷萃取，收集上层有机相；
31、4)重复步骤3)若干次并合并收集的有机相，通过旋蒸使正己烷挥发，得到油脂。
32、进一步地，所述平板培养基ph值为6.4，含博来霉素zeocin抗性用于筛选，浓度为80-100μg/ml，其他成分包括：琼脂20g/l，葡萄糖40g/l，酵母提取物15g/l，硫酸钠10g/l，硫酸镁3g/l，硫酸铵8g/l，氯化钾2g/l，氯化钙0.1g/l，硫酸钾0.8g/l，磷酸二氢钾0.8g/l，谷氨酸钠8g/l，七水硫酸锌5mg/l，六水合二氯化钴0.05mg/l，五水硫酸铜4mg/l，六水硫酸镍1mg/l，七水硫酸亚铁8mg/l，泛酸钙3mg/l，四水氯化锰5mg/l，钼酸钠二水0.04mg/l，维生素b67 mg/l、维生素b121 mg/l，溶剂为水；
33、其中，所述种子培养基的ph值为6.4，且包括：葡萄糖60g/l，酵母提取物5g/l，硫酸钠5g/l，硫酸镁2g/l，硫酸铵4g/l，氯化钾1g/l，氯化钙0.1g/l，硫酸钾0.5g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，谷氨酸钠8g/l，七水硫酸锌3mg/l，六水合二氯化钴0.03mg/l，五水硫酸铜4mg/l，六水硫酸镍1mg/l，七水硫酸亚铁8mg/l，泛酸钙2mg/l，四水氯化锰4mg/l，钼酸钠二水0.04mg/l，溶剂为水；
34、其中，所述发酵培养基的ph值为6.0，且包括：葡萄糖90g/l，酵母提取物15g/l，硫酸钠10g/l，硫酸镁3g/l，硫酸铵8g/l，氯化钾2g/l，氯化钙0.1g/l，硫酸钾0.8g/l，磷酸二氢钾1g/l，谷氨酸钠15g/l，七水硫酸锌3mg/l，六水合二氯化钴0.08mg/l，五水硫酸铜5mg/l，六水硫酸镍1mg/l，七水硫酸亚铁10mg/l，泛酸钙2mg/l，四水氯化锰4mg/l，钼酸钠二水0.04mg/l，维生素b68 mg/l、维生素b122 mg/l，溶剂为水。
35、本发明取得的优点和积极效果为：
36、1、本发明采用裂殖壶菌schizochytrium sp.hx-308为原始菌株，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，其保藏编号为cctcc no.m 209059。通过基因工程手段在大肠杆菌中构建替换载体，选择博莱霉素(zeocin)作为筛选抗性基因，将线性化的基因替换片段电转进入裂殖壶菌内，得到有效提高epa产量的基因工程菌株，为产品工业化奠定了理论基础。
37、2、本发明在裂殖壶菌现有转化系统基础上，使用电击转化的方法，通过同源重组将裂殖壶菌内源性的orfa亚基和orfb亚基上的酮酰基合酶/链长因子(ksb/clf)基因替换为photobacteriumprofundum来源的pfaa亚基和pfac亚基基因，以此构建的裂殖壶菌工程菌株，在多次传代培养后依然保持遗传稳定性。
38、3、本发明在裂殖壶菌schizochytrium sp.hx-308天然存在的pks脂质合成途径中，将裂殖壶菌内源性的orfa亚基和orfb亚基上的酮酰基合酶/链长因子(ksb/clf)基因替换为photobacteriumprofundum中pfaa亚基和pfac亚基基因，从而改变决定产物链长的关键基因酮酰基合酶(ksa和ksb/clf)为photobacteriumprofundum来源的epa生产型酮酰基合酶(ksa和ksc/clf)，并同时引入photobacteriumprofundum中决定产物不饱和键位置的脱水酶(dhfaba)基因，获得的基因工程菌株具有高效合成epa的能力，有效提高epa的产量，为epa的大规模工业化生产奠定了基础。
39、4、本发明中得到的裂殖壶菌基因工程菌株orfa::pfaa和ksb/clf::pfac经发酵后产生的epa分别达到总油脂含量的4.24％和10.19％，epa含量分别提高了2.52和7.47倍，相比目前裂殖壶菌schizochytrium属野生型菌株，epa产量大幅度提高，说明本发明提供的方法具有极高的应用潜力。
40、5、本发明旨在鉴定裂殖壶菌内源和其他海洋原核生物宿主来源的pks途径中关键功能域的作用，确定影响最终产物链长和不饱和键位置的关键基因，找到影响二十碳五烯酸合成的关键因素，以达到对该菌株简便、快速、有效、精准构建的目标，以实现提高二十碳五烯酸产量。
1.一种高效生产epa的裂殖壶菌基因工程菌株，其特征在于：所述基因工程菌株是通过将裂殖壶菌pks途径中关键催化结构域orfa、orfb-ksb/clf替换为异源epa型pks途径中对应功能域得到的，该基因工程菌株能够改善基因工程菌株中的多不饱和脂肪酸，尤其是二十碳五烯酸的占比。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于：所述基因工程菌株为替换pks中关键基因酮酰基合酶ksa所在的orfa亚基为photobacteriumprofundum中ksa功能域所在的pfaa亚基的裂殖壶菌基因工程菌株，所述菌株是以产油schizochytrium sp.hx-308为出发菌株构建而成，所述菌株含有来源于photobacteriumprofundum的pfaa功能域，用于替换schizochytrium sp.hx-308内源存在的orfa功能域，以提高裂殖壶菌hx-308中的epa的百分含量；
3.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于：所述基因工程菌株为替换pks中orfb亚基上关键基因酮酰基合酶ksb/clf为photobacteriumprofundum中ksc/clf和脱水酶dhfaba功能域所在的pfac亚基的裂殖壶菌基因工程菌株，所述菌株是以产油schizochytrium sp.hx-308为出发菌株构建而成，所述菌株含有来源于photobacteriumprofundum的pfac功能域，用于替换schizochytrium sp.hx-308内源存在的orfb功能域上的ksb/clf基因，以提高裂殖壶菌hx-308中的epa的百分含量；
4.根据权利要求1或2所述的基因工程菌株，其特征在于：所述裂殖壶菌基因工程菌株经发酵后产生的epa分别达到总油脂含量的4.24％和10.19％，epa含量分别提高了2.52和7.47倍。
5.如权利要求1至4任一项所述的基因工程菌株的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
6.如权利要求1至4任一项所述的基因工程菌株在生产epa中的应用。
7.一种利用如权利要求1至4任一项所述的基因工程菌株定向生产epa的方法，其特征在于：将所述基因工程菌株接种于种子培养基活化培养后，获得发酵种子菌种；将所述发酵种子菌种接种于发酵培养基中进行发酵培养，收集菌体、提取脂质，得到epa。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：具体步骤如下：
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：具体步骤如下：
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述平板培养基ph值为6.4，含博来霉素zeocin抗性用于筛选，浓度为80-100μg/ml，其他成分包括：琼脂20g/l，葡萄糖40g/l，酵母提取物15g/l，硫酸钠10g/l，硫酸镁3g/l，硫酸铵8g/l，氯化钾2g/l，氯化钙0.1g/l，硫酸钾0.8g/l，磷酸二氢钾0.8g/l，谷氨酸钠8g/l，七水硫酸锌5mg/l，六水合二氯化钴0.05mg/l，五水硫酸铜4mg/l，六水硫酸镍1mg/l，七水硫酸亚铁8mg/l，泛酸钙3mg/l，四水氯化锰5mg/l，钼酸钠二水0.04mg/l，维生素b67 mg/l、维生素b121 mg/l，溶剂为水；
