本发明涉及生物和医学检验，更具体地，涉及陈旧骨骼检材dna提取，特别是指一种陈旧骨骼检材免脱钙微量dna提取方法。
背景技术：
1、骨骼是一类特殊的生物检材，是一种致密的结缔组织，含有大量钙化合物，大大减缓了微生物对骨骼内部细胞或dna的分解作用，使骨骼检材相对于人体其它的组织脏器腐败降解得更慢。因此在法医学实际案件中，针对高度腐败、白骨化的尸体，骨骼是身份认定dna检验的唯一生物检材。
2、陈旧骨骼检材以长期土埋类骨骼检材居多，保存时间长，保存环境复杂，导致陈旧骨骼检材具有样本降解严重、泥土杂质含量高、金属杂质含量高等问题，从而使陈旧骨骼检材成为法医学实际案件检验中的难点。
3、针对陈旧骨骼检材，传统方法往往需要增加骨粉量以提高样本dna总量，但同时也引入过多杂质。为消除骨粉中钙元素和泥土中金属杂质的影响，则需在骨粉孵育前使用0.5mol/l edta脱钙液(ph 8.0)单独脱钙12h，之后离心弃掉脱钙液后，再进行骨粉孵育步骤。如将edta脱钙液直接引入骨孵育液，过多金属杂质与脱钙液络合后产物不稳定，容易在提取环境下析出细小颗粒杂质，对磁珠吸附dna效率产生影响，且金属离子或析出杂质如不能有效去除，则会对后续pcr扩增产生影响，因此传统方法采用单独脱钙的方式，但会导致骨屑表层骨细胞中的dna在脱钙过程中损失，影响陈旧骨骼检材检出效果，且增加提取检验时间。
4、因此，针对上述情况，有必要开发一种针对陈旧骨骼检材免脱钙的微量dna提取方法，其能够从陈旧骨骼检材中有效提取纯化微量dna，无需单独脱钙前处理，避免样本损失，提取的dna可以用于法医学鉴定，可以为案件侦破和法庭审判提供更为有效的依据。
技术实现思路
1、为了克服上述现有技术中的缺点，本发明的一个目的在于提供一种陈旧骨骼检材免脱钙微量dna提取方法，其能够从陈旧骨骼检材中有效提取纯化微量dna，无需单独脱钙前处理，避免样本损失，提取的dna可以用于法医学鉴定，可以为案件侦破和法庭审判提供更为有效的依据，适于大规模推广应用。
2、本发明的另一目的在于提供一种陈旧骨骼检材免脱钙微量dna提取方法，其设计巧妙，构思独特，操作简便，免去单独脱钙步骤，简化操作流程，缩短提取时间，适于大规模推广应用。
3、为达到以上目的，本发明提供一种陈旧骨骼检材免脱钙微量dna提取方法，其特点是，包括以下步骤：
4、(1)孵育：将取自陈旧骨骼检材的骨粉、骨孵育液、蛋白酶k溶液和dtt溶液混匀后孵育，期间多次剧烈摇匀，离心得到第一上清液，其中所述骨孵育液包括0.05wt％～0.2wt％的十二烷基硫酸钠、5mmol/l～15mmol/l的edta、10mmol/l～40mmol/l的tris-hcl、0.1mol/l～0.5mol/l的特定金属螯合剂和0.05mmol/l～0.3mmol/l的氨基磷酸酯衍生物，所述骨孵育液的ph值为7.5～8.5，所述特定金属螯合剂选自亚氨基二琥珀酸四钠盐、谷氨酸二乙酸四钠、n，n-二羧甲基丙氨酸三钠盐、葡萄糖酸钠和乙二胺二邻苯基乙酸钠中的一种或多种；
5、(2)在所述第一上清液中加入羧酸基阳离子树脂，混匀后进行金属浴，离心得到第二上清液；
6、(3)在所述第二上清液中加入骨吸附液和磁珠悬浊液，翻转混匀吸附，然后磁吸，吸弃所有液体，得到吸附有dna的磁珠；
7、(4)对所述的吸附有dna的磁珠进行洗涤和洗脱，得到所述陈旧骨骼检材的dna溶液。
8、较佳地，在所述步骤(1)中，所述骨粉1g～3g，所述骨孵育液3ml～5ml，所述蛋白酶k溶液100ul～300ul，所述蛋白酶k溶液的浓度为20mg/ml，所述dtt溶液20ul～60ul，所述dtt溶液的浓度为1mol/l，所述孵育的温度为37℃～56℃，所述孵育的时间为1h～12h，所述剧烈摇匀的次数为5次～8次，所述离心的转速为7000rpm～10000rpm，所述离心的时间为5分钟～8分钟。
9、较佳地，在所述步骤(1)中，所述氨基磷酸酯衍生物选自α-氨基磷酸酯、β-氨基磷酸酯和γ-氨基磷酸酯中的一种或多种，其中，所述氨基为无取代氨基、一取代氨基或二取代氨基，所述氨基的取代基为脂肪族基团，所述氨基磷酸酯为长度小于5个碳的脂肪醇磷酸酯。
10、较佳地，在所述步骤(2)中，所述羧酸基阳离子树脂10mg～50mg，所述金属浴的温度为60℃～90℃，所述金属浴的时间为10分钟～20分钟，所述离心的转速为7000rpm～10000rpm，所述离心的时间为2分钟～4分钟。
11、较佳地，在所述步骤(3)中，所述骨吸附液8ml～15ml，所述骨吸附液包括3.0mol/l～6.0mol/l的异硫氰酸胍、10mmol/l～40mmol/l的tris-hcl和1.5mol/l～3mol/l的乙二醇，所述骨吸附液的ph值为3～5，所述磁珠悬浊液为30ul～60ul，所述翻转混匀吸附的时间为20分钟～30分钟，所述磁吸的时间为5分钟～10分钟；
12、较佳地，在所述步骤(3)中，所述磁珠悬浊液包括9wt％的尺寸为100nm～2000nm的二氧化硅磁性复合微粒，所述二氧化硅磁性复合微粒是由两个或更多个铁氧体-二氧化硅核壳纳米粒子交联而成的交联体，并且所述二氧化硅磁性复合微粒的表面具有多个纳米级尺寸的突起。
13、较佳地，在所述步骤(4)中，所述洗涤的具体步骤包括：对所述的吸附有dna的磁珠采用洗涤液i进行第一次洗涤和磁吸，吸弃所有液体，采用洗涤液ii进行第二次洗涤和磁吸，吸弃所有液体，采用洗涤液iii进行第三次洗涤和磁吸，吸弃所有液体。
14、更佳地，在所述步骤(4)中，所述洗涤液i包括2mol/l～5mol/l的异硫氰酸胍、5mmol/l～25mmol/l的tris-hcl和10mmol/l～50mmol/l的特定金属螯合剂，所述洗涤液i的使用量为300ul～700ul，所述洗涤液ii包括2mol/l的氯化钠、体积百分比为50％的无水乙醇、体积百分比为20％的异丙醇和体积百分比为30％的水，所述洗涤液ii的使用量为600ul～1000ul，所述洗涤液iii包括体积百分比为50％的无水乙醇和体积百分比为50％的异丙醇，所述洗涤液iii的使用量为600ul～1000ul。
15、较佳地，在所述步骤(4)中，所述洗脱的具体步骤包括：将所述的吸附有dna的磁珠干燥后加水混匀进行溶解，混匀磁吸后得到的液体即为所述dna溶液。
16、更佳地，在所述步骤(4)中，所述干燥采用65℃金属浴5分钟～10分钟，所述水的用量为20ul～100ul，所述溶解采用65℃金属浴10分钟，所述磁吸的时间为2分钟。
17、本发明的有益效果在于：
18、1、本发明的陈旧骨骼检材免脱钙微量dna提取方法不采用单独脱钙步骤，并且在骨孵育液中引入特定金属螯合剂和氨基磷酸酯衍生物，特定金属螯合剂对钙、镁离子有较强的螯合能力，且特定金属螯合剂及其络合产物水溶性强，不易析出，容易去除，不会对磁珠吸附dna效率及后续pcr扩增产生影响，氨基磷酸酯衍生物优先与泥土表面的磷酸基团固定位点作用，极大地减小泥土对dna的吸附，能够最大限度地获得孵育产物，随后通过离心将泥土杂质除去，确保对后续磁珠吸附dna无不良影响，因此，其能够从陈旧骨骼检材中有效提取纯化微量dna，无需单独脱钙前处理，避免样本损失，提取的dna可以用于法医学鉴定，可以为案件侦破和法庭审判提供更为有效的依据，适于大规模推广应用。
19、2、本发明的陈旧骨骼检材免脱钙微量dna提取方法不采用单独脱钙步骤，并且在骨孵育液中引入特定金属螯合剂和氨基磷酸酯衍生物，特定金属螯合剂对钙、镁离子有较强的螯合能力，且特定金属螯合剂及其络合产物水溶性强，不易析出，容易去除，不会对磁珠吸附dna效率及后续pcr扩增产生影响，氨基磷酸酯衍生物优先与泥土表面的磷酸基团固定位点作用，极大地减小泥土对dna的吸附，能够最大限度地获得孵育产物，随后通过离心将泥土杂质除去，确保对后续磁珠吸附dna无不良影响，因此，其设计巧妙，构思独特，操作简便，免去单独脱钙步骤，简化操作流程，缩短提取时间，适于大规模推广应用。
20、本发明的这些和其它目的、特点和优势，通过下述的详细说明和权利要求得以充分体现，并可通过所附权利要求中特地指出的手段、装置和它们的组合得以实现。
1.一种陈旧骨骼检材免脱钙微量dna提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的陈旧骨骼检材免脱钙微量dna提取方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述骨粉1g～3g，所述骨孵育液3ml～5ml，所述蛋白酶k溶液100ul～300ul，所述蛋白酶k溶液的浓度为20mg/ml，所述dtt溶液20ul～60ul，所述dtt溶液的浓度为1mol/l，所述孵育的温度为37℃～56℃，所述孵育的时间为1h～12h，所述剧烈摇匀的次数为5次～8次，所述离心的转速为7000rpm～10000rpm，所述离心的时间为5分钟～8分钟。
3.根据权利要求1所述的陈旧骨骼检材免脱钙微量dna提取方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述氨基磷酸酯衍生物选自α-氨基磷酸酯、β-氨基磷酸酯和γ-氨基磷酸酯中的一种或多种，其中，所述氨基为无取代氨基、一取代氨基或二取代氨基，所述氨基的取代基为脂肪族基团，所述氨基磷酸酯为长度小于5个碳的脂肪醇磷酸酯。
4.根据权利要求1所述的陈旧骨骼检材免脱钙微量dna提取方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述羧酸基阳离子树脂10mg～50mg，所述金属浴的温度为60℃～90℃，所述金属浴的时间为10分钟～20分钟，所述离心的转速为7000rpm～10000rpm，所述离心的时间为2分钟～4分钟。
5.根据权利要求1所述的陈旧骨骼检材免脱钙微量dna提取方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述骨吸附液8ml～15ml，所述骨吸附液包括3.0mol/l～6.0mol/l的异硫氰酸胍、10mmol/l～40mmol/l的tris-hcl和1.5mol/l～3mol/l的乙二醇，所述骨吸附液的ph值为3～5，所述磁珠悬浊液为30ul～60ul，所述翻转混匀吸附的时间为20分钟～30分钟，所述磁吸的时间为5分钟～10分钟。
6.根据权利要求1所述的陈旧骨骼检材免脱钙微量dna提取方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述磁珠悬浊液包括9wt％的尺寸为100nm～2000nm的二氧化硅磁性复合微粒，所述二氧化硅磁性复合微粒是由两个或更多个铁氧体-二氧化硅核壳纳米粒子交联而成的交联体，并且所述二氧化硅磁性复合微粒的表面具有多个纳米级尺寸的突起。
7.根据权利要求1所述的陈旧骨骼检材免脱钙微量dna提取方法，其特征在于，在所述步骤(4)中，所述洗涤的具体步骤包括：对所述的吸附有dna的磁珠采用洗涤液i进行第一次洗涤和磁吸，吸弃所有液体，采用洗涤液ii进行第二次洗涤和磁吸，吸弃所有液体，采用洗涤液iii进行第三次洗涤和磁吸，吸弃所有液体。
8.根据权利要求7所述的陈旧骨骼检材免脱钙微量dna提取方法，其特征在于，在所述步骤(4)中，所述洗涤液i包括2mol/l～5mol/l的异硫氰酸胍、5mmol/l～25mmol/l的tris-hcl和10mmol/l～50mmol/l的特定金属螯合剂，所述洗涤液i的使用量为300ul～700ul，所述洗涤液ii包括2mol/l的氯化钠、体积百分比为50％的无水乙醇、体积百分比为20％的异丙醇和体积百分比为30％的水，所述洗涤液ii的使用量为600ul～1000ul，所述洗涤液iii包括体积百分比为50％的无水乙醇和体积百分比为50％的异丙醇，所述洗涤液iii的使用量为600ul～1000ul。
9.根据权利要求1所述的陈旧骨骼检材免脱钙微量dna提取方法，其特征在于，在所述步骤(4)中，所述洗脱的具体步骤包括：将所述的吸附有dna的磁珠干燥后加水混匀进行溶解，混匀磁吸后得到的液体即为所述dna溶液。
10.根据权利要求9所述的陈旧骨骼检材免脱钙微量dna提取方法，其特征在于，在所述步骤(4)中，所述干燥采用65℃金属浴5分钟～10分钟，所述水的用量为20ul～100ul，所述溶解采用65℃金属浴10分钟，所述磁吸的时间为2分钟。
