本发明涉及一种制备羧甲基化黄原胶-硫酸酯化黄原胶-甲基丙烯酰化明胶水凝胶支架的方法。属于天然高分子材料，这种羧甲基化黄原胶-硫酸酯化黄原胶-甲基丙烯酰化明胶水凝胶三维贯通多孔支架可广泛应用于骨组织修复与再生和生物医用材料及药物可控释放等领域。
背景技术：
1、研制理想的人工骨支架材料替代骨移植手术，是修复骨缺损的重要途径之一。骨组织工程研究早期，人们利用金属材料、无机材料、高分子材料，或复合材料，采用各种技术制备与骨骼结构相似的多孔性生物支架材料，并将细胞装载在生物支架材料中构建人工骨组织，且在小动物骨缺损修复的实验中取得成功，由此证实了骨组织工程技术的可行性和巨大的临床应用前景。但早期所构建的骨组织材料的结构、形貌、生物学表现等与生理状态下的骨组织有极大的不同，不能满足临床应用的实际需要。最近，利用具有骨传导能力的材料，如 b-磷酸三钙与具有骨诱导能力的物质如骨生长因子等复合制备成具有仿生人工骨复杂结构的支架材料。骨组织工程研究虽然取得了长足进步，但无论是基础研究还是临床应用方面仍然存在着诸多问题。构建与天然骨组织化学结构和力学性能类似的仿生骨组织、保证营养物质、氧气及代谢产物在仿生骨组织中的持续供应和排出是针对骨组织工程临床应用所必须解决的关键技术问题。另外，骨组织修复及再生过程中，存在细菌感染风险。高分子水凝胶具有三维贯通多孔结构,适合模拟细胞外基质，提供适合细胞生长所需的微环境及维持细胞正常表型与生理功能。采用胶原蛋白或胶原蛋白类似结构的高分子、聚阴离子（羧酸基团或磺酸基团）或聚阳离子多糖制备水凝胶，在模拟体液或在植入动物组织中矿化形成含羟基磷灰石矿物质的仿生骨组织，从而进一步开发具有天然骨组织相媲美的人工骨组织。
2、黄原胶是由d-葡聚糖、d-甘露糖、d-葡萄糖醛酸、乙酸和丙酮酸构成的“五糖重复单元”连接而成的线性水溶性天然多糖。以黄原胶为原料所制备的水凝胶亲水性强、无毒、可降解、生物相容性好，常用作高吸水性树脂、药物载体和微胶囊等，在生物医用领域具有广泛的应用前景。黄原胶侧链上的葡萄糖醛酸和丙酮酸基团及整个分子主链结构中的大量羟基，有利于黄原胶的化学修饰及改性。将黄原胶进行羧甲基化，可提高黄原胶分子链上羧基的含量，从而制备出分子链上带更多负电荷、更亲水和更易溶的羧甲基化黄原胶衍生物。将黄原胶进行硫酸酯化，可将磺酸基团修饰到黄原胶分子链上，所制备的硫酸酯化黄原胶分子链上既含有羧基也含有磺酸基，且具有更高的负电荷。将黄原胶进行化学修饰后形成的水凝胶分子链上会带有大量负电荷，同时通过羧甲基化黄原胶和硫酸酯化黄原胶组合模拟骨组织中的硫酸软骨素调控水凝胶支架的生物矿化，更利于离子沉积且矿化。明胶是胶原水解所得的产物，属蛋白质大分子范畴，且其降解性和生物相容性好，在生物医学领域具有广阔应用前景。然而，明胶机械强度较差限制其应用。用甲基丙烯酸酐修饰明胶，使其分子链上含有不饱和键，制备出的甲基丙烯酰化明胶可以在光引发剂下，光照交联形成三维网络结构的水凝胶。通过调控甲基丙烯酰化明胶的浓度及光交联时间，制备出力学性能可控的水凝胶，从而满足不同力学性能需求的水凝胶支架。迄今为止，甲基丙烯酰化明胶基生物材料因其物理和生化特性而被广泛研究，其应用范围从药物控制释放到组织工程。苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂是一种水溶性、细胞相容的光引发剂，因为其更高的水溶性、更高的光引发效率、以及可在更低的光辐射强度下，快速引发双键交联反应，该光引发剂优于irgacure 2959，更适用于光交联制备生物材料及组织工程材料的光引发剂。
3、基于以上分析，结合羧甲基化黄原胶和硫酸酯化黄原胶与甲基丙烯酰化明胶的优点，用苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂作光引发剂经紫外光交联的复合生物医用水凝胶支架材料的制备存在着极大的优势。该水凝胶不仅可提供维持细胞生长的微环境且具有高强度、高粘度和剪切变稀的特性，适合可注射性和3d打印特征，从而有望应用于生物医学及组织工程领域。另外，该水凝胶中羧甲基化黄原胶和硫酸酯化黄原胶分子链上带有大量负电荷，可以通过静电作用诱导模拟体液或生物组织中钙离子和磷酸根离子沉积于水凝胶中，从而形成矿化的水凝胶支架，该水凝胶支架在骨组织修复领域有广阔的应用前景。另外，将药物或细胞生长因子等包埋在水凝胶支架中，在骨修复及再生过程中，提供抗生素或细胞生长因子等，可抑制感染且促进骨修复及再生。羧甲基化黄原胶-硫酸酯化黄原胶-甲基丙烯酰化明胶水凝胶作为一种良好的支架材料，不仅仅取决于它的生物相容性及可生物降解性，更重要的是它的独特化学结构及高强度、高粘度、剪切变稀且剪切力去掉后迅速恢复高粘度的特性。羧甲基化黄原胶-硫酸酯化黄原胶-甲基丙烯酰化明胶水凝胶在骨组织工程、药物控制释放、3d打印等领域具有广阔的应用前景。
4、正因为天然高分子复合水凝胶存在极大的应用价值，因此其制备及应用开发成为目前国内、外研究热点之一。研制理想的人工支架材料代替骨组织移植手术修复组织缺损或病变，是生物材料科学和医学领域的重要课题之一。3d生物打印领域的重要突破口就是设计出满足多重生物打印需求的水凝胶材料。目前商业打印凝胶包括天然多糖、蛋白质和合成高分子等，都不能很好的兼顾高强度和生物降解安全性这两大需求。例如：中国专利公开号为cn116236621a，公开日为2023年6月9日，发明名称为“一种3d打印生物杂化水凝胶及其制备方法和应用”的申请案。该申请案公开了由明胶、黄原胶和油凝胶剂为原料制成的水凝胶，其流变学性能好，符合3d打印的基本要求。该方法的缺点在于：黄原胶与明胶之间仅依靠物理作用，没有化学键的交联，因此该复合水凝胶的机械强度有待进一步提高。中国专利公开号为cn115671385a，公开日为2023年2月3日，发明名称为“一种新型3d生物活性骨修复材料的制备”的申请案。该申请案公开了通过对聚乳酸多孔支架表面包被聚多巴胺并滴加微球溶液，使微球粘附于支架表面，形成新型3d生物活性骨修复材料。该方法的缺点在于：聚乳酸的缓慢生物降解速率可能导致慢性炎症和组织坏死。因此该水凝胶的安全性有待提高。
技术实现思路
1、针对上述技术存在的不足，本发明的目的是提供一种原材料来源丰富，污染小，具有良好的生物相容性和生物降解性、良好的力学性能及生物矿化性能、药物可控性释放、以及可3d打印的水凝胶支架的制备方法，由该方法所得产品可快速成型、可注射、可3d打印。
2、为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：
3、一种制备羧甲基化黄原胶-硫酸酯化黄原胶-甲基丙烯酰化明胶水凝胶支架的方法，所述的制备方法包括以下步骤：
4、a 在25 ℃温度下，将黄原胶分散在20 wt% naoh和异丙醇混合溶液中，搅拌2 h后形成黄原胶-naoh-异丙醇均匀悬浮液，其中黄原胶与异丙醇的质量体积比为：1:25，20wt％naoh与异丙醇的体积比为2:5；
5、b 将氯乙酸溶于异丙醇中，并缓缓逐滴到经a步骤得到的黄原胶-naoh-异丙醇均匀悬浮液中，在60 ℃温度下反应3 h，停止反应后冷却至室温，然后用0.5 m 乙酸溶液中和至ph＝7，将经上述反应所得的产物用蒸馏水透析，冷冻干燥即得羧甲基化黄原胶，其中，黄原胶羟基与氯乙酸的摩尔比为1:5，氯乙酸与异丙醇的质量体积比为2.63:5；
6、c 将黄原胶分散在二甲亚砜中，在25 ℃温度下搅拌24 h配成黄原胶溶液，所得黄原胶溶液的质量体积浓度为6％；
7、d 将吡啶加到经c步骤得到的黄原胶溶液中，在25 ℃温度下搅拌30 min后，缓缓逐滴加入氯磺酸，在60 ℃温度下反应4 h，停止反应后冷却至室温，然后用5 wt% naoh溶液中和至ph＝7，将经上述反应所得的产物用蒸馏水透析，冷冻干燥即得硫酸酯化黄原胶，其中，吡啶与氯磺酸酸的摩尔比为2:1，黄原胶羟基与氯磺酸的摩尔比为1:5；
8、e 将明胶分散在ph＝7.4的磷酸盐缓冲溶液中，在60 ℃温度下搅拌60 min配成明胶溶液，所得明胶溶液的质量体积浓度为10％；
9、f 将甲基丙烯酸酐缓慢逐滴加到经e步骤得到的明胶溶液中，在60 ℃温度下反应3 h，停止加热后，再加入磷酸盐缓冲溶液搅拌，冷却至40 ℃，将经上述反应所得的产物用蒸馏水透析，冷冻干燥即得甲基丙烯酰化明胶，明胶与甲基丙烯酸酐的质量体积比为10:1～5:4；
10、g 将经b步骤得到的羧甲基化黄原胶和经d步骤得到的硫酸酯化黄原胶共同溶解在去离子水中得质量体积浓度为0.5～6 %的羧甲基化黄原胶-硫酸酯化黄原胶溶液，其中，羧甲基化黄原胶和硫酸酯化黄原胶的质量比为10：1～1：10；
11、h 将苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂分散在去离子水中，在70 ℃烘箱中加热15 min，得浓度为0.05 wt%～1 wt%的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂水溶液；
12、i 将经f步骤得到的甲基丙烯酰化明胶溶解在经h步骤得到的0.05 wt%～1 wt%的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂水溶液光引发剂中，得质量体积浓度为5～20 %的甲基丙烯酰化明胶溶液；
13、j 将经g步骤得到的羧甲基化黄原胶-硫酸酯化黄原胶溶液加到经i步骤得到的甲基丙烯酰化明胶溶液中，搅拌2 h，在365 nm或405 nm光辐射交联10 s~600 s，得羧甲基化黄原胶-硫酸酯化黄原胶-甲基丙烯酰化明胶水凝胶支架。
14、由于采用了以上技术方案，本发明的技术方案针对羧甲基化黄原胶和硫酸酯化黄原胶、甲基丙烯酰化明胶的化学结构特点，采用苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂紫外光交联制备可生物矿化、药物可控释放且力学性能良好的羧甲基化黄原胶-硫酸酯化黄原胶-甲基丙烯酰化明胶水凝胶支架，将药物或细胞生长因子包埋在该水凝胶支架中，通过调节羧甲基化黄原胶、硫酸酯化黄原胶与甲基丙烯酰化明胶的含量比例来调节水凝胶的力学性能及多孔结构的孔径大小。甲基丙烯酰化明胶通过双键光交联形成三维网状结构，提高甲基丙烯酰化明胶的含量可以提高水凝胶支架的力学性能，从而制备力学性能良好的水凝胶支架。甲基丙烯酰化明胶加入光引发剂后在紫外灯照射下能快速凝胶，这种快速凝胶的能力符合目前流行的3d打印技术的要求。3d打印技术一个重要的参数是前体溶液的粘度，合适的粘度可以确保凝胶的成功凝胶化，防止挤出凝胶在固化前坍塌，并保持被包裹细胞的活力。羧甲基化黄原胶和硫酸酯化黄原胶具有高粘度，利用羧甲基化黄原胶和硫酸酯化黄原胶来调节甲基丙烯酰化明胶溶液的粘度，以确保光交联前结构的稳定性。甲基丙烯酰化明胶通过苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂作光引发剂进行紫外光交联形成三维网络，羧甲基化黄原胶和硫酸酯化黄原胶分子链穿插在网络中，从而制备羧甲基化黄原胶-硫酸酯化黄原胶-甲基丙烯酰化明胶水凝胶支架。黄原胶分别进过羧甲基化和硫酸酯化后，分子链带负电荷，可以吸引钙离子在该水凝胶支架上沉积，然后吸引磷酸根离子沉积，经过多次沉积达到良好的矿化效果。羧甲基化黄原胶和硫酸酯化黄原胶中的羧甲基和磺酸基团、以及甲基丙烯酰化明胶中的带电荷基团可通过静电作用诱导模拟体液或生物组织中的钙离子和磷酸根离子沉积，从而促进骨组织的修复和再生。因此，该水凝胶支架在骨组织工程中具有广阔的应用前景。
15、本发明制备羧甲基化黄原胶-硫酸酯化黄原胶-甲基丙烯酰化明胶水凝胶支架的方法与已有技术相比具有以下优点：
16、本发明制备方法具有原料来源丰富、所制备的水凝胶支架具有与天然骨组织类似的化学组成。天然人骨组织中含约25%质量分数的有机基质，约65%质量分数的矿物质，10%质量分数的水，其中有机基质中约90%质量分数的为胶原蛋白、约10%质量分数的为硫酸软骨素类高分子。通过羧甲基化黄原胶和硫酸酯化黄原胶组合模拟硫酸软骨素调控水凝胶支架的生物矿化，采用甲基丙烯酰化明胶替代胶原蛋白，甲基丙烯酰化明胶分子链上存在双键，在光引发剂作用下，可进行光交联形成三维网络结构的水凝胶，从而改善水凝胶的力学性能。由此制备方法得到的羧甲基化黄原胶-硫酸酯化黄原胶-甲基丙烯酰化明胶水凝胶支架，用作药物载体时可控制药物缓慢释放，提高药效；作为组织工程支架材料时可装载细胞生长因子且模拟细胞外基质控制细胞生长因子缓慢释放的功能，从而诱导细胞增殖分化成再生组织。实验表明，本方法所得的羧甲基化黄原胶-硫酸酯化黄原胶-甲基丙烯酰化明胶水凝胶支架具有三维贯通的多孔结构，包埋环丙沙星盐时具有良好的可控释放行为。此外，本方法所得的水凝胶具有良好的生物矿化性能、力学性能和生物相容性。除此之外，该水凝胶支架还具有高的强度和弹性，可制备成水凝胶膜和水凝胶纤维。因此，该方法可广泛应用于制备人工骨组织支架材料，而且在药物控制释放，3d生物打印及可注射生物材料等领域也具有广阔的应用前景。
1.一种制备羧甲基化黄原胶-硫酸酯化黄原胶-甲基丙烯酰化明胶水凝胶支架的方法，其特征在于：所述的方法按以下步骤进行：
