本发明涉及生物医药领域，更具体的本发明是涉及一种检测cfdna完整性的引物组合物、引物探针组合物、试剂盒及其应用。
背景技术：
0、技术背景
1、游离核酸(cfdna)存在于细胞外、血浆和各种其他生物体液中，包括dna、mrna、线粒体dna等。游离核酸dna(cfdna)由血液中的核dna片段组成，起源于体内的各种细胞。cfdna的释放有细胞凋亡、坏死或炎性细胞分泌过程。cfdna存在和cfdna完整性可以反映机体不同的生理或病理状态。从凋亡细胞释放的dna片段通常长度为185至200个碱基对(bp)，这种均匀截短的dna是在凋亡过程中通过程序化的酶促切割过程产生的。相反，来自坏死细胞或者肿瘤细胞的cfdna片段更长，表明dna的无序分解更多。因此，高水平的长dna片段可以作为疾病潜在的标志。来自坏死的长dna片段(alu247)与代表总cfdna的短凋亡片段(alu115)的比值代表cfdna完整性的水平，该比率越高，越有利于疾病发生和发展。
2、现有技术中尚未公开一种合适的alu115、alu247引物和探针组合对cfdna完整性进行检测。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本发明提供了一种检测cfdna完整性的引物组合物、引物探针组合物、试剂盒及其应用。
2、一方面，本发明提供了一种检测cfdna完整性的引物组合物，包括alu115上游引物、alu115下游引物、alu247上游引物、alu247下游引物；所述alu115上游引物的核苷酸序列如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3或seq id no.4所示，所述alu115下游引物的核苷酸序列如seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7或seq id no.8所示。
3、另一方面，本发明提供了一种检测cfdna完整性的引物探针组合物，包括alu115引物探针组合物和alu247引物探针组合物，所述alu115引物探针组合物包括所述alu115上游引物、所述alu115下游引物以及alu115探针，所述alu247引物探针组合物包括所述alu247上游引物、所述alu247下游引物以及alu247探针；所述alu115探针的核苷酸序列如seq idno.9或seq id no.10所示，所述alu247探针的核苷酸序列如seq id no.19或seq id no.20所示。
4、再一方面，本发明提供了一种检测cfdna完整性的试剂盒，包括所述alu115引物探针组合物和所述alu247引物探针组合物，还包括内控基因引物探针组合物即内控基因上游引物、内控基因下游引物和内控基因探针，所述内控基因上游引物的核苷酸序列如seq idno.21或seq id no.22所示，所述内控基因下游引物的核苷酸序列如seq id no.23或seqid no.24所示，所述内控基因探针的核苷酸序列如seq id no.25或seq id no.26所示；
5、优选地，所述探针的5’端标记有荧光报告基团。
6、进一步优选地，所述荧光报告基团为fam、hex、vic、rox、tamra或cy5的至少一种；
7、更进一步优选地，所述探针alu115和alu247探针5’端标记有fam荧光基团，内控基因探针5’端标记有hex荧光基团；
8、优选地，所述探针的3’端标记有淬灭基团；
9、进一步优选地，所述探针3’端淬灭基团为tamra、bhq1、bhq2、mgb、dabcyl或bhq3中的至少一种；
10、更进一步优选地，所述探针alu115，alu247探针3’端标记有mgb淬灭基团，内控基因探针3’端标记有bhq1淬灭基团。
11、优选地，所述alu115引物探针组合物为以下组合中的一种：
12、1)用于alu115基因位置1水平检测的引物探针组合：sseq id no.1、seq id no.5和seq id no.9；
13、2)用于alu115基因位置2水平检测的引物探针组合：seq id no.1、seq id no.7和seq id no.10；
14、3)用于alu115基因位置3水平检测的引物探针组合：seq id no.2、seq id no.6和seq id no.10；
15、4)用于alu115基因位置4水平检测的引物探针组合：seq id no.2、seq id no.8和seq id no.9；
16、5)用于alu115基因位置5水平检测的引物探针组合：seq id no.3、seq id no.5和seq id no.10；
17、6)用于alu115基因位置6水平检测的引物探针组合：seq id no.4、seq id no.6和seq id no.9；
18、优选地，所述alu247引物探针组合物为以下组合中的一种：
19、1)用于alu247基因位置1水平检测的引物探针组合：seq id no.11、seq id no.16和seq id no.19；
20、2)用于alu247基因位置2水平检测的引物探针组合：seq id no.11、seq id no.17和seq id no.20；
21、3)用于alu247基因位置3水平检测的引物探针组合：seq id no.12、seq id no.15和seq id no.20；
22、4)用于alu247基因位置4水平检测的引物探针组合：seq id no.12、seq id no.18和seq id no.19；
23、5)用于alu247基因位置5水平检测的引物探针组合：seq id no.13、seq id no.15和seq id no.19；
24、6)用于alu247基因位置6水平检测的引物探针组合：seq id no.14、seq id no.18和seq id no.20；
25、优选地，所述内控基因引物探针组合物为以下组合中的一种：
26、1)用于拟南芥内控基因位置1水平检测的引物探针组合：seq id no.21和seq idno.23和seq id no.25；
27、2)用于拟南芥内控基因位置2水平检测的引物探针组合：seq id no.22和seq idno.24和seq id no.25；
28、3)用于拟南芥内控基因位置3水平检测的引物探针组合：seq id no.22、seq idno.24和seq id no.26。
29、优选地，所述的alu115和alu247的核苷酸序列如seq id no.27所示。
30、优选地，所述内控基因的核苷酸序列如seq id no.28所示。
31、优选地，所述alu115基因位置1在seq id no.27第64-178个碱基处，alu115基因位置2在seq id no.27第64-187个碱基处，alu115基因位置3在seq id no.27第63-176个碱基处，alu115基因位置4在seq id no.27第63-188个碱基处；alu115基因位置5在seq idno.27第81-178个碱基处，alu115基因位置6在seq id no.27第74-176个碱基处；alu247基因位置1在seq id no.27第12-275个碱基处，alu247基因位置2在seq id no.27第12-280个碱基处，alu247基因位置3在seq id no.27第18-258个碱基处，alu247基因位置4在seq idno.27第18-253个碱基处，alu247基因位置5在seq id no.27第19-258个碱基处；alu247基因位置6在seq id no.27第19-253个碱基处；内控基因位置1在seq id no.28第338-440个碱基处，内控基因位置2在seq id no.28第352-441个碱基处，内控基因位置3在seq idno.28第352-441个碱基处。
32、进一步地，所述的试剂盒包括前述引物探针组合物之外，还包括pcr缓冲液(20mmtris-so4、8mm mgcl2、50mm k2so4、0.2mm dntp、5％甘油、0.1％吐温、1m甜菜碱、10mmtmac)、taq酶以及内控质粒，所述内控质粒的核苷酸序列如seq id no.28所示。
33、最后，本发明提供了前述引物组合物、引物探针组合物、试剂盒在制备用于检测cfdna完整性的产品中的应用。
34、具体地，所述的产品包括但不限于用于检测cfdna完整性水平的试剂或试剂盒。
35、进一步地，利用所述产品检测cfdna完整性水平的方法，包括以下步骤：
36、1)提取人类基因组dna；
37、采用健康人的血清/血浆循环dna提取试剂盒提取人外周血液dna，外周血液dna经过紫外分光光度计检测后，要求dna浓度不低于40ng/μl，od260/od280比值不低于1.80；
38、2)将样本dna利用前述的引物探针组合物进行pcr扩增alu115和alu247基因，alu115基因ct值通过fam通过测得，alu247基因ct值通过fam通过测得和内控基因ct值通过hex测得。
39、3)将提取样本的cfdna和来自白细胞人类基因组dna标准物质连续稀释通过pcr试剂进行pcr反应，通过建立相应的标曲计算alu115和aul247浓度。通过aul247与alu115浓度比值来评估的cfdna完整性。
40、优选地，步骤2，3)所述alu115和alu247基因的检测分两管进行独立扩增检测(即alu115和alu247分别独立扩增)，alu115和alu247基因的pcr扩增的反应体系如下所示：
41、
42、进一步优选地，步骤2，3)中所述alu115和alu247基因pcr扩增的反应体系为反应体系2，各试剂加样量如下所示：
43、
44、
45、优选地，步骤2，3)alu115和alu247基因扩增程序如下：
46、
47、进一步地，上述检测方法中还包括内控，通过加入内控引物探针组合物，在特异性实时定量荧光pcr检测时进行内控检测，当内控探针所在荧光通道的ct值小于设定值且扩增曲线正常，则判断样本检测正常。该方法利用针对alu115和alu247基因设计的特异性引物探针，并选择拟南芥作为内控，整个检测方法具有操作流程简单、检测时间短、特异性高等优点。
48、本发明的有益效果是：本发明提供针对alu115和alu247基因的特异性引物和探针组合物，不产生其余等位基因的非特异性扩增，达到检测的高特异性和高灵敏度。利用特异性引物和探针组合物进行cfdna完整性的检测，具有检测时间短和成本低的优点，可用于cfdna水平检测的快速检测。
1.一种检测cfdna完整性的引物组合物，其特征在于：包括alu115上游引物、alu115下游引物、alu247上游引物、alu247下游引物；所述alu115上游引物的核苷酸序列如seq idno.1、seq id no.2、seq id no.3或seq id no.4所示，所述alu115下游引物的核苷酸序列如seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7或seq id no.8所示。
2.一种检测cfdna完整性的引物探针组合物，其特征在于：包括alu115引物探针组合物和alu247引物探针组合物，所述alu115引物探针组合物包括权利要求1所述的引物组合物中的所述alu115上游引物、所述alu115下游引物以及alu115探针，所述alu247引物探针组合物包括权利要求1所述的引物组合物中的所述alu247上游引物、所述alu247下游引物以及alu247探针；所述alu115探针的核苷酸序列如seq id no.9或seq id no.10所示，所述alu247探针的核苷酸序列如seq id no.19或seq id no.20所示。
3.根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于：所述alu115引物探针组合物为以下序列组合中的一种：
4.一种检测cfdna完整性的试剂盒，其特征在于：包括权利要求2或3所述的引物探针组合物中的所述alu115引物探针组合物和所述alu247引物探针组合物，还包括内控基因引物探针组合物即内控基因上游引物、内控基因下游引物和内控基因探针，所述内控基因上游引物的核苷酸序列如seq id no.21或seq idno.22所示，所述内控基因下游引物的核苷酸序列如seq id no.23或seq idno.24所示，所述内控基因探针的核苷酸序列如seq idno.25或seq id no.26所示。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述内控基因引物探针组合物为以下组合中的一种：
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述alu115探针的5’端采用fam荧光基团修饰；3’端采用mgb基团修饰，所述alu247探针的5’端采用fam荧光基团修饰，3’端采用mgb基团修饰；所述内控基因探针的5’端采用hex荧光基团修饰，3’端采用bhq1基团修饰。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：还包括pcr反应液和内控质粒，所述pcr反应液包括反应缓冲液和taq酶。
8.如权利要求1所述的引物组合物、权利要求2所述的引物探针组合物、权利要求4所述的试剂盒在制备检测cfdna完整性的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述产品用于检测cfdna完整性的方法包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：步骤(2)中，alu115和alu247分别独立扩增，扩增的反应体系为：2×pcr反应缓冲液12.5μl，5u/μltaq酶0.5μl，alu115/alu247探针1μl，10μm alu115/alu247上游引物1μl，10μm alu115/alu247下游引物1μl，10μm内控基因探针0.5μl，10μm内控基因上游引物0.8μl，10μm内控基因下游引物0.8μl，内控质粒2μl，基因组dna样本2μl，用水补足体积至25μl；
