本发明涉及毒素检测，尤其涉及一种麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素检测试纸及其制备方法与应用。
背景技术：
1、麻痹性贝类毒素(psp)是全球分布最广、危害最大的一类海洋生物毒素，主要由海洋中的单细胞甲藻产生。psp是一类四氢嘌呤的三环化合物，在弱酸和低温条件下比较稳定，通常的烹调方法不能改变其结构及降低其毒性。psp污染的贝类被人类食用后，会在30min至3h内产生四肢面部肌肉麻痹、头痛恶心等症状，严重时可窒息死亡。目前已发现的psp有二十几种，其中石房蛤毒素(saxitoxin，stx)占psp主要成份的85％以上，是主要毒素。贝类可以通过滤食性把赤潮藻内的毒素富集，并转化为stx的形式保存在体内，国际上多数国家都以stx为贝类产品中麻痹性贝毒的检测指标，联合国粮农组织(fao)和世界卫生组织(who)均规定贝类中psp的限量标准为80μgstx/100g。
2、腹泻性贝类毒素(dsp)是由有毒赤潮藻类鳍藻属和原甲藻属的一些种类产生的脂溶性多环醚类生物活性物质。dsp的化学结构特征是聚醚或大环内酯化合物，根据这些成分的碳骨架结构可以将其分成三组：①酸性成分：软海绵酸(oa)及其天然衍生物—鳍藻毒素(dtx-3)；②中性成分：聚醚内酯—蛤毒素(ptxi-vn)；③其他成分：磺化毒物、紫夷贝毒素(ytx)及其衍生物。oa和dtxs毒素都高效、专一性地抑制pp1和pp2a型蛋白磷酸酶，尤其是pp2a型，能够剧烈地增强大多数蛋白质的磷酸化作用，引起腹泻、呕吐、恶心、腹痛和头痛，一般在食用后30min到14h发病，48h内恢复健康。dsp不是一种可致命的毒素，通常只引起轻微的胃肠疾病，而症状也会很快消灭，没有强烈的急性毒性，但oa是强烈的致癌因子。
3、麻痹性贝类毒素与腹泻性贝类毒素对人体毒性强，危害大，是影响公共健康的重要因素。因此，加强对海产品中麻痹性贝类毒素与腹泻性贝类毒素检测至关重要。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素检测试纸及其制备方法与应用，可检测出麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素。
2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
3、本发明提供了一种麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素检测试纸的制备方法，包括如下步骤：
4、(1)制备麻痹性贝毒抗原stx-bsa和腹泻性贝毒抗原oa-bsa；
5、(2)使用步骤(1)制备的两种抗原免疫小鼠，检测其血清滴度，筛选小鼠加强免疫；
6、(3)加强免疫3天后取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤细胞，筛选杂交瘤细胞并注射入小鼠体内，继续培养；
7、(4)采集腹部明显隆起小鼠的腹水，离心分离腹水中细胞后，注射入小鼠体内，继续培养；
8、(5)取注射腹水中细胞的小鼠腹水，检测抗体效价，筛选抗体，并纯化得到麻痹性贝毒单克隆抗体和腹泻性贝毒单克隆抗体；
9、(6)将麻痹性贝毒单克隆抗体和腹泻性贝毒单克隆抗体分别与时间分辨荧光微球偶联，得到时间分辨荧光微球标记抗体；
10、(7)将麻痹性贝毒时间分辨荧光微球标记抗体和腹泻性贝毒时间分辨荧光微球标记抗体均匀喷洒在玻璃纤维结合垫上，以步骤(1)制备的stx-bsa作为检测1线、oa-bsa作为检测2线，羊抗鼠igg作为质控线制备麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素检测试纸。
11、优选的，步骤(1)所述麻痹性贝毒抗原stx-bsa的制备方法为：在醋酸缓冲液中加入bsa和stx，用甲醛作交联剂，37℃反应72小时；
12、所述腹泻性贝毒抗原oa-bsa的制备方法为：在交联剂中加入腹泻性贝毒oa，振荡反应后，加入bsa-pbs液，4℃过夜，透析得到oa-bsa。
13、优选的，所述交联剂由50μg水溶性碳二亚胺和30μgn-羟基琥珀酰亚胺溶于10μl纯水中制备得到。
14、优选的，步骤(2)所述筛选小鼠的条件为：小鼠血清滴度大于1×104。
15、优选的，步骤(3)所述筛选杂交瘤细胞的条件为：杂交瘤细胞培养液抗体滴度大于1×103。
16、优选的，步骤(5)所述筛选腹水中抗体的条件为：腹水抗体效价大于1×107。
17、优选的，步骤(6)所述偶联的ph为6.0～7.5；偶联时时间分辨荧光微球与抗体的质量比为1mg:5～100μg。
18、优选的，步骤(7)所述结合垫上麻痹性贝毒时间分辨荧光微球标记抗体和腹泻性贝毒时间分辨荧光微球标记抗体的浓度分别为：0.1mg/ml～1mg/ml；喷洒量分别为1μl～10μl；所述检测1线上stx-bsa的浓度为100μg/ml～500μg/ml，喷洒量为1μl～10μl；检测2线上oa-bsa的浓度为100μg/ml～500μg/ml，喷洒量为1μl～10μl；质控线c上羊抗鼠igg的浓度为100μg/ml～500μg/ml，喷洒量为1μl～10μl。
19、本发明还提供了一种上述麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素检测试纸的制备方法制备的麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素检测试纸。
20、本发明还提供了一种麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素检测试纸在麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素检测上的应用。
21、优选的，所述麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素检测试纸载板，所述载板上依次固定有样品垫、抗体结合垫、层析硝酸纤维膜、吸水垫；所述层析硝酸纤维膜上设有检测1线、检测2线和质控线，所述质控线设置在靠近所述吸水垫的一端。
22、本发明所述的麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素检测试纸与现有技术相比的有益效果为：
23、本发明制备了麻痹性贝毒抗原stx-bsa和腹泻性贝毒抗原oa-bsa，并用其免疫小鼠制备杂交瘤细胞，然后得到麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素的单克隆抗体，并将麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素的单克隆抗体喷涂至结合垫，麻痹性贝毒抗原stx-bsa和腹泻性贝毒抗原oa-bsa分别作为检测线进行毒素检测。本发明的麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素检测试纸，可对贝类中的麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素进行检测，麻痹性贝毒的检测限为50ng/ml，腹泻性贝毒的检测限为100ng/ml，低于检测限时浓度较低，视为未检出。
1.一种麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素检测试纸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素检测试纸的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述麻痹性贝毒抗原stx-bsa的制备方法为：在醋酸缓冲液中加入bsa和stx，用甲醛作交联剂，37℃反应72小时；
3.根据权利要求2所述麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素检测试纸的制备方法，其特征在于，所述交联剂由50 μg水溶性碳二亚胺和30 μg n-羟基琥珀酰亚胺溶于10 μl纯水中制备得到。
4.根据权利要求1所述麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素检测试纸的制备方法，其特征在于，在步骤（2）中所述筛选小鼠的条件为：小鼠血清滴度大于1×104；在步骤（3）中所述筛选杂交瘤细胞的条件为：杂交瘤细胞培养液抗体滴度大于1×103。
5.根据权利要求1所述麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素检测试纸的制备方法，其特征在于，在步骤（5）中所述筛选腹水中抗体的条件为：腹水抗体效价大于1×107。
6.根据权利要求1所述麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素检测试纸的制备方法，其特征在于，在步骤（6）中所述偶联的ph为6.0~7.5；偶联时时间分辨荧光微球与抗体的质量比为1mg:5~100 μg。
7.据权利要求1所述麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素检测试纸的制备方法，其特征在于，在步骤（7）中所述结合垫上麻痹性贝毒时间分辨荧光微球标记抗体和腹泻性贝毒时间分辨荧光微球标记抗体的浓度分别为：0.1mg/ml~1mg/ml；喷洒量分别为1 μl~10 μl；所述检测1线上stx-bsa的浓度为100 μg/ml~500 μg/ml，喷洒量为1 μl~10 μl；检测2线上oa-bsa的浓度为100 μg/ml~500 μg/ml，喷洒量为1 μl~10 μl；质控线c上羊抗鼠igg的浓度为100 μg/ml~500 μg/ml，喷洒量为1 μl~10 μl。
8.一种根据权利要求1~7任一项所述麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素检测试纸的制备方法制备的麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素检测试纸。
9.根据权利要求8所述麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素检测试纸，其特征在于，所述麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素检测试纸包括载板，所述载板上依次固定有样品垫、抗体结合垫、层析硝酸纤维膜、吸水垫；所述层析硝酸纤维膜上设有检测1线、检测2线和质控线，所述质控线设置在靠近所述吸水垫的一端。
10.一种权利要求8~9任一项所述麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素检测试纸在麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素检测上的应用。
