本发明涉及生物医药领域，更具体的，涉及一种修饰细胞内源性cd5基因的方法、由该方法制备得到的内源性cd5基因修饰的细胞及其应用。
背景技术：
1、目前，疾病仍是破坏人类生命健康的首要障碍。为此，研发人员付出巨大的努力，开发出了包括细胞治疗在内的免疫治疗方法，通过靶向疾病靶点发挥作用，以实现安全、有效的治疗目的。但是，当向受试者施用靶向与疾病或病症相关的抗原的免疫疗法(例如car-t细胞疗法)时，该疗法不仅可以耗尽旨在靶向的病理性细胞，还存在耗尽可以表达靶向抗原的非病理性细胞的风险。一些car-t细胞疗法(例如针对靶点cd19或cd33的疗法)已报道了这种情形。如果靶向抗原表达在受试者生存所需的正常细胞表面上，或者表达在若消耗则会明显损害受试者身体健康的细胞表面上，则受试者可能无法接受该免疫疗法，或需要承受一旦施用这种疗法则可能出现的严重的副作用。另一种情况下，当需要施用的免疫疗法所使用的免疫效应细胞上也表达同样的抗原时，例如靶抗原也表达在car-t细胞的细胞表面上时，就可能导致免疫效应细胞的自相残杀并使得相应疗法无法实现预期的效果或完全不产生作用。
2、解决方案例如可以采用基因编辑的方法来制备相关抗原表达缺失的细胞，以降低或弥补这些问题带来的不良后果。例如，若受试者的健康造血细胞表达抗原，则可以制备工程化的造血细胞，使得所述细胞的相关抗原的表达缺失，再向受试者施用这类工程化造血细胞(如造血干细胞或祖细胞)，这些造血干细胞或祖细胞能够重新补强受试者体内的造血能力，并且经增殖重建各种造血谱系，包括可能已被靶向治疗药物清除的造血谱系。
3、cd5也被称为lyt-1，属于i型跨膜糖基化蛋白，cd5被认为是一种泛t细胞标记物，其在t细胞、胸腺细胞和b细胞子集(称为b-1a细胞)的各个发育和激活阶段有表达。cd5在t细胞受体信号传导的负调控中起着重要作用，并被认为也在免疫耐受和负调节b细胞受体信号传导中发挥作用。cd5也是恶性t细胞肿瘤的特征性表面标志物之一，大约80％的t细胞恶性肿瘤表达cd5，例如，在80％的t-all患者和约75％的外周t细胞淋巴瘤患者中都高表达cd5。此外，cd5也在一些恶性b细胞肿瘤中表达，例如，套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(b-cll)和毛细胞白血病(hcl)的肿瘤细胞中也会表达cd5。因此，其是治疗此类疾病的有吸引力的靶标。
4、为此，本发明提供了经修饰使内源性cd5基因表达降低的细胞，这种细胞不会成为靶向免疫治疗药物的目标，也就不会产生被药物“意外”清除的问题。所述细胞能够施用于接受靶向抗原治疗的受试者，例如，通过施用所述细胞从而以便于替换可能已被靶向治疗药物靶向并杀死的健康细胞，或是提供对靶向治疗药物有抗性的健康细胞群。
5、在细胞的基因编辑(修饰)领域中常用的基因编辑系统包括，例如zfns、talens、crispr/cas系统等。crispr基因编辑系统是一种快速、有效的基因编辑方法，其中的crispr/cas9系统是应用最广泛的crispr/cas系统之一，其能够高效、精确地对目标dna序列进行修饰、替换和插入，在许多生物学应用中显示出巨大的潜力。crispr/cas9系统进行基因编辑的机制包括：与特定靶序列(原间隔序列)同源的crispr阵列被转录为许多前crispr rna(pre-crrna)，这些pre-crrna与更小的反式激活crrna(tracrrna)通过碱基配对形成复合物。这种复合物可以与cas9蛋白结合，导致较长的pre-crrna被rna酶iii切割，分离成单独的crrna/tracrrna复合物。当crrna/tracrrna将cas9复合物引导至目标序列时，crrna结合原间隔序列相邻基序(pam)后的目标序列，靶序列解旋，并被cas9蛋白的核酸酶结构域(ruvc和hnh)切割，造成双链断裂。进而激活细胞的非同源末端连接(non-homologous end joining,nhej)或同源定向修复(homology directed repair,hdr)两种修复机制，从而实现基因的敲除、插入或修饰。通过将crrna和tracrrna进行生物工程改造，组合成为一个具备crrna和tracrrna功能的向导rna(guide rna，grna)分子。grna分子与目标dna序列互补匹配，并决定了cas9蛋白定向切割的特异性。grna分子的一部分序列可以与cas核酸酶结合，另外一部分序列可以与靶基因的部分序列互补，借助grna分子的识别作用使得cas核酸酶可以在靶基因特定位点形成单链或双链切口，从而实现对靶基因的编辑。
6、近年来，基于crispr/cas9基因编辑系统高效精准的基因编辑功能，其在哺乳动物细胞的基因编辑中得到了广泛应用，这也促进了肿瘤免疫治疗的极大进步，尤其是极大促进了嵌合抗原受体t细胞(car-t细胞)的制备和应用。
7、嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,car)修饰的t细胞作为一种免疫治疗策略，在许多实体肿瘤、血液系统肿瘤，尤其是淋巴细胞肿瘤的治疗中受到广泛的应用。嵌合抗原受体是一种重组多肽构建体，其代表性结构由细胞外抗原结合结构域(通常为具有抗原识别功能的单链抗体)、铰链区、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域四部分组成。通常根据细胞内信号传导结构域是否加入共刺激分子以及加入的数量，将经典的嵌合抗原受体结构分为第一代(无共刺激分子)、第二代(包含一种共刺激分子)和第三代(包含两种共刺激分子)。截止目前，第二代嵌合抗原受体结构设计在上市产品和临床研究阶段中应用最多。嵌合抗原受体的原理为通过基因工程修饰，使t细胞表达可以特异性识别肿瘤细胞表面抗原的受体结构(例如，单链抗体)，并在该受体与肿瘤细胞表面抗原特异性结合后，激活其下游的免疫共刺激分子和t细胞，突破主要组织相容性复合体(mhc)的限制性，直接特异性识别并杀伤肿瘤细胞，实现靶向清除恶性肿瘤的目的。
8、由于cd5抗原表达在成熟的t细胞表面，因此在制备靶向cd5的car-t细胞的过程中存在car-t细胞识别自身抗原而导致自相残杀的现象，这一现象导致car-t细胞存续时间和杀伤能力显著降低。为解决该“自杀”现象带来的问题，本发明采用crispr/cas9基因编辑系统预先对t细胞进行基因修饰，使得cd5基因表达降低。
技术实现思路
1、本发明提供了修饰内源性cd5基因的方法以及由该方法制备的细胞，如造血细胞、免疫细胞、淋巴细胞(例如t细胞)。所述细胞具有降低的cd5抗原表达，使其能够不被cd5特异性免疫疗法识别。本发明还提供了向受试者施用该细胞或包含其的组合物，以解决免疫治疗中的脱靶问题的方法，所述细胞或包含其的组合物对cd5特异性免疫疗法的杀伤具有抗性。本发明提供的内源性cd5基因修饰的细胞还能够解决靶向cd5的免疫效应细胞的自相残杀问题，例如当所述细胞是靶向cd5的car-t细胞时，其具有降低的cd5抗原表达，因此可以减弱或不发生靶向cd5的car-t细胞的自相残杀现象，从而提高了相应细胞的生物活性，保证治疗的有效性。
2、根据本公开的第一方面，本发明提供一种修饰细胞内源性cd5基因的方法，所述方法包括：
3、提供一种待基因修饰的细胞；
4、将试剂引入待基因修饰的细胞中，所述试剂包含：(i)靶向细胞内源性cd5基因的grna或用于表达所述grna的表达载体，其中所述grna包含间隔序列，所述间隔序列为选自
5、seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq idno:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17或seq id
6、no:18任一所示的核酸序列，和(ii)cas9蛋白或其功能性变体、或表达所述cas9蛋白或其功能性变体的表达载体；
7、收获经基因修饰的细胞；
8、使得所述经基因修饰的细胞中的cd5抗原的表达减少。
9、在一些实施方案中，本发明提供一种修饰细胞内源性cd5基因的方法，所述方法包括：
10、提供一种待基因修饰的细胞；
11、将试剂引入待基因修饰的细胞中，所述试剂包含：(i)靶向细胞内源性cd5基因的grna或用于表达所述grna的表达载体，其中所述grna包含间隔序列，所述间隔序列为选自
12、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12或seq id no:17任一所示的核酸序列，和(ii)cas9蛋白或其功能性变体、或表达所述cas9蛋白或其功能性变体的表达载体；
13、收获经基因修饰的细胞；
14、使得所述经基因修饰的细胞中的cd5抗原的表达减少。
15、在一些实施方案中，本发明提供的方法使得所述经基因修饰的细胞中的cd5抗原的表达减少至少50％、减少至少60％或减少至少70％。
16、在一些实施方案中，本发明提供的方法使得所述经基因修饰的细胞中的cd5抗原的表达减少至少50％、减少至少60％、减少至少70％、减少至少80％或减少至少90％。
17、在一些实施方案中，本发明提供的方法中将试剂引入待基因修饰的细胞的方式包括电穿孔、核转染、病毒转导或转染、脂质纳米粒转导。在一些实施方案中，所述引入待基因修饰的细胞的方式为电穿孔。
18、本发明提供的方法中所述的grna分子与cas9蛋白一起使用，以实现对细胞内源性cd5基因的基因编辑。cas9蛋白表现出核酸酶活性，其在靶位点中或直接邻近靶位点引入双链dna断裂。各种cas核酸酶(例如cas9)是本领域已知的并且可以从各种来源获得和/或被改造/修饰以调节酶的一种或多种活性或特异性。合适的cas9核酸酶(例如spcas9和sacas9)的pam序列和特异性是本领域已知的。
19、在一些实施方案中，本发明提供的方法所述待基因修饰的细胞为干细胞。在一些实施方案中，本发明提供的方法所述干细胞可以选自胚胎干细胞(esc)、诱导多能干细胞(ipsc)、间充质干细胞或组织特异性干细胞或它们的任何组合。
20、在一些实施方案中，本发明提供的方法所述待基因修饰的细胞为造血细胞。
21、在一些实施方案中，本发明提供的方法所述造血细胞为造血干细胞或造血祖细胞。
22、在一些实施方案中，本发明提供的方法所述待基因修饰的细胞为免疫效应细胞。
23、在一些实施方案中，本发明提供的方法所述免疫效应细胞可以选自t细胞、b细胞、nk细胞、巨噬细胞、树突状细胞、由诱导性多能干细胞(ipsc)分化而成的免疫效应细胞或它们的任何组合。
24、在一些实施方案中，本发明提供的方法所述免疫效应细胞为t细胞。在一些实施方案中，本发明提供的方法所述t细胞可以选自cd4+/cd8+t细胞、cd4+/cd8-t细胞、cd4-/cd8+t细胞、cd4-/cd8-t细胞、cd4+辅助t细胞(例如th1和th2细胞)、cd8+t细胞(例如，细胞毒性t细胞)、肿瘤浸润细胞、记忆t细胞、幼稚t细胞、γδ-t细胞、αβ-t细胞、nkt细胞、dnt细胞(双阴性t细胞)。
25、在一些实施方案中，本发明提供的方法所述t细胞是cd4+/cd8-t细胞、cd4-/cd8+t细胞、cd4+/cd8+t细胞、cd4-/cd8-t细胞或它们的任何组合。
26、在一些实施方案中，本发明提供的修饰细胞内源性cd5基因的方法，还包括以下步骤：在将所述试剂引入待基因修饰的细胞之前进行配制试剂的步骤，该步骤包括：将crrna和tracrrna混合以形成grna复合物，以及将grna复合物与cas9蛋白混合，从而得到试剂。
27、在一些实施方案中，本发明提供的修饰细胞内源性cd5基因的方法，还包括以下步骤：在将所述试剂引入待基因修饰的细胞之前进行配制试剂的步骤，该步骤包括：将crrna和tracrrna按照比例1:1加入到至nuclease-free duplex buffer中，总体积为100μl，在95℃的温度下退火5min，得到的grna复合物，以及将grna复合物与cas9蛋白混合，从而得到试剂。
28、在一些实施方案中，本发明提供的修饰细胞内源性cd5基因的方法，还包括以下步骤：在将所述试剂引入待基因修饰的细胞之前进行配制试剂的步骤，该步骤包括：将crrna和tracrrna按照比例1:1加入到至nuclease-free duplex buffer中，总体积为100μl，在95℃的温度下退火5min，得到的grna复合物，以及在opti-mem中分别加入grna复合物、cas9蛋白和1μm电穿孔增强子，从而得到试剂。
29、在一些实施方案中，本发明提供的修饰细胞内源性cd5基因的方法，还包括在将试剂引入待基因修饰的细胞之前将细胞活化。
30、在一些实施方案中，本发明提供的修饰细胞内源性cd5基因的方法，还包括在收获经基因修饰的细胞后，扩增获得的细胞。
31、根据本公开的第二方面，本发明提供了一种将包含表达能够特异性识别抗原的靶向配体的核酸分子的载体转导进入本公开第一方面制备得到的细胞的方法。
32、在一些实施方案中，本发明提供的将包含表达能够特异性识别抗原的靶向配体的核酸分子的载体转导进入本公开第一方面制备得到的细胞的方法包括：在将试剂引入待基因修饰的细胞之前将包含表达能够特异性识别抗原的靶向配体的核酸分子的载体转导进入细胞。在一些实施方案中，本发明提供的将包含表达能够特异性识别抗原的靶向配体的核酸分子的载体转导进入本公开第一方面制备得到的细胞的方法包括：在将试剂引入待基因修饰的细胞之后将包含表达能够特异性识别抗原的靶向配体的核酸分子的载体转导进入细胞。
33、在一些实施方案中，本发明提供的方法所述的能够特异性识别抗原的靶向配体可以选自嵌合抗原受体(car)、t细胞抗原受体(tcr)或b细胞抗原受体(bcr)。在一些实施方案中，本发明提供的方法所述的能够特异性识别抗原的靶向配体为嵌合抗原受体(car)。
34、在一些实施方案中，本发明提供的方法所述的载体为病毒载体或非病毒载体。在一些实施方案中，本发明提供的方法所述的病毒载体可以选自慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。在一些实施方案中，本发明提供的方法所述的病毒载体为慢病毒载体。
35、在一些实施方案中，本发明提供的将包含表达能够特异性识别抗原的靶向配体的核酸分子的载体转导进入第一方面制备得到的细胞的方法，包括如下步骤：按照本公开的第一方面所述的方法制备内源性cd5基因修饰的细胞；将包含表达能够特异性识别抗原的靶向配体的核酸分子的载体转导进入细胞。
36、在一些实施方案中，本发明提供一种将包含表达能够特异性识别cd5抗原的嵌合抗原受体的核酸分子的载体转导进入按照本公开第一方面所述的方法制备得到的细胞的方法。
37、在一些实施方案中，本发明提供一种制备内源性cd5基因修饰的嵌合抗原受体t细胞的方法，其中所述方法包括如前所述的细胞制备方法，所述细胞为人t细胞。
38、根据本公开的第三方面，本发明提供一种靶向细胞内源性cd5基因的grna，所述grna包含间隔序列，所述间隔序列为如seq id no:1-18中任一所示的核酸序列。
39、在一些实施方案中，本发明提供的靶向细胞内源性cd5基因的grna，所述grna包含间隔序列，所述间隔序列为如seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12或seq id no:17任一所示的核酸序列。
40、在一些实施方案中，本发明提供的靶向细胞内源性cd5基因的grna，所述grna包含间隔序列，所述间隔序列为如seq id no:1所示的核酸序列。
41、在一些实施方案中，本发明提供的靶向细胞内源性cd5基因的grna，所述grna包含间隔序列，所述间隔序列为如seq id no:2所示的核酸序列。
42、在一些实施方案中，本发明提供的靶向细胞内源性cd5基因的grna，所述grna包含间隔序列，所述间隔序列为如seq id no:3所示的核酸序列。
43、在一些实施方案中，本发明提供的靶向细胞内源性cd5基因的grna，所述grna包含间隔序列，所述间隔序列为如seq id no:4所示的核酸序列。
44、在一些实施方案中，本发明提供的靶向细胞内源性cd5基因的grna，所述grna包含间隔序列，所述间隔序列为如seq id no:5所示的核酸序列。
45、在一些实施方案中，本发明提供的靶向细胞内源性cd5基因的grna，所述grna包含间隔序列，所述间隔序列为如seq id no:6所示的核酸序列。
46、在一些实施方案中，本发明提供的靶向细胞内源性cd5基因的grna，所述grna包含间隔序列，所述间隔序列为如seq id no:7所示的核酸序列。
47、在一些实施方案中，本发明提供的靶向细胞内源性cd5基因的grna，所述grna包含间隔序列，所述间隔序列为如seq id no:8所示的核酸序列。
48、在一些实施方案中，本发明提供的靶向细胞内源性cd5基因的grna，所述grna包含间隔序列，所述间隔序列为如seq id no:9所示的核酸序列。
49、在一些实施方案中，本发明提供的靶向细胞内源性cd5基因的grna，所述grna包含间隔序列，所述间隔序列为如seq id no:10所示的核酸序列。
50、在一些实施方案中，本发明提供的靶向细胞内源性cd5基因的grna，所述grna包含间隔序列，所述间隔序列为如seq id no:11所示的核酸序列。
51、在一些实施方案中，本发明提供的靶向细胞内源性cd5基因的grna，所述grna包含间隔序列，所述间隔序列为如seq id no:12所示的核酸序列。
52、在一些实施方案中，本发明提供的靶向细胞内源性cd5基因的grna，所述grna包含间隔序列，所述间隔序列为如seq id no:13所示的核酸序列。
53、在一些实施方案中，本发明提供的靶向细胞内源性cd5基因的grna，所述grna包含间隔序列，所述间隔序列为如seq id no:14所示的核酸序列。
54、在一些实施方案中，本发明提供的靶向细胞内源性cd5基因的grna，所述grna包含间隔序列，所述间隔序列为如seq id no:15所示的核酸序列。
55、在一些实施方案中，本发明提供的靶向细胞内源性cd5基因的grna，所述grna包含间隔序列，所述间隔序列为如seq id no:16所示的核酸序列。
56、在一些实施方案中，本发明提供的靶向细胞内源性cd5基因的grna，所述grna包含间隔序列，所述间隔序列为如seq id no:17所示的核酸序列。
57、在一些实施方案中，本发明提供的靶向细胞内源性cd5基因的grna，所述grna包含间隔序列，所述间隔序列为如seq id no:18所示的核酸序列。
58、本发明所公开的技术方案，其中，seq id no:1-18所示的具体核酸序列信息如表1中所示。
59、表1
60、
61、本发明提供的grna能够结合至细胞内源性cd5基因组中的靶位点，可以实现基因组的有效、甚至是更高效的修饰，导致细胞的cd5抗原表达降低，或不被靶向cd5的免疫治疗药物识别，从而使得经基因修饰的细胞具备医疗应用前景。
62、根据本公开的第四方面，本发明提供一种用于制备内源性cd5基因修饰的细胞的试剂，所述试剂包含：
63、(i)靶向细胞内源性cd5基因的grna或用于表达所述grna的表达载体，其中所述grna包含间隔序列，所述间隔序列为选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq idno:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq idno:16、seq id no:17或seq id no:18任一所示的核酸序列，和(ii)cas9蛋白或其功能性变体、或表达所述cas9蛋白或其功能性变体的表达载体。
64、在一些实施方案中，本发明提供一种用于制备内源性cd5基因修饰的细胞的试剂，所述试剂包含：
65、(i)靶向细胞内源性cd5基因的grna或用于表达所述grna的表达载体，其中所述grna包含间隔序列，所述间隔序列为选自seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seqid no:12或seq id no:17任一所示的核酸序列，和(ii)cas9蛋白或其功能性变体、或表达所述cas9蛋白或其功能性变体的表达载体。
66、根据本公开的第五方面，本发明提供一种内源性cd5基因修饰的细胞，所述细胞为通过本公开的第一方面所述的方法制备获得。
67、在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的细胞中的cd5抗原表达减少至少50％、减少至少60％或减少至少70％。
68、在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的细胞中的cd5抗原表达减少至少50％、减少至少60％、减少至少70％、减少至少80％或减少至少90％。
69、在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的细胞，还包含能够特异性识别抗原的靶向配体。在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的细胞，还包含能够特异性识别抗原的靶向配体可以选自嵌合抗原受体(car)、t细胞抗原受体(tcr)、b细胞抗原受体(bcr)。在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的细胞，还包含能够特异性识别抗原的靶向配体为嵌合抗原受体(car)。
70、在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的细胞，其中嵌合抗原受体(car)包含能够特异性识别cd5抗原的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的细胞，其中嵌合抗原受体还进一步包含共刺激结构域。
71、在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的细胞，其中能够特异性识别cd5抗原的细胞外抗原结合结构域包含单链抗体(scfv)、单域抗体(sdab)或重链抗体(hcab)。在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的细胞，其中能够特异性识别cd5抗原的细胞外抗原结合结构域包含单链抗体(scfv)。在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的细胞，其中能够特异性识别cd5抗原的细胞外抗原结合结构域包含单域抗体(sdab)。
72、在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的细胞，其中跨膜结构域来源于cd8α和/或cd28。在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的细胞，其中细胞内信号传导结构域来源于cd3ζ。在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的细胞，其中共刺激信号结构域来源于cd28、cd27、4-1bb(cd137)、ox40和/或cd278(icos)。
73、在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的细胞，其中嵌合抗原受体进一步包含位于细胞外抗原结合结构域c端和跨膜结构域n端之间的铰链区。在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的细胞，其中铰链区来源于cd8α。
74、在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的细胞，其中嵌合抗原受体进一步包含位于嵌合抗原受体多肽n端的信号肽。在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的细胞，其中信号肽来源于hla-a和/或cd8α。
75、在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的细胞为造血细胞。
76、在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的造血细胞为造血干细胞或造血祖细胞。
77、在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的细胞为免疫效应细胞。
78、在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的免疫效应细胞可以选自t细胞、b细胞、nk细胞、巨噬细胞、树突状细胞、由诱导性多能干细胞(ipsc)分化而成的免疫效应细胞或它们的任何组合。
79、在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的免疫效应细胞为t细胞。在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的t细胞可以选自cd4+/cd8+t细胞、cd4+/cd8-t细胞、cd4-/cd8+t细胞、cd4-/cd8-t细胞、cd4+辅助t细胞(例如th1和th2细胞)、cd8+t细胞(例如，细胞毒性t细胞)、肿瘤浸润细胞、记忆t细胞、幼稚t细胞、γδ-t细胞、αβ-t细胞、nkt细胞、dnt细胞(双阴性t细胞)。
80、在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的t细胞可以选自cd4+/cd8-t细胞、cd4-/cd8+t细胞、cd4+/cd8+t细胞、cd4-/cd8-t细胞或它们的任何组合。
81、根据本公开的第六方面，本发明提供一种基因编辑系统，所述基因编辑系统包含本公开第三方面所述的grna或第四方面所述的试剂。
82、本发明的基因编辑系统选自crispr/cas系统。crispr/cas系统包括i型、ii型、iii型、iv型、v型或vi型crispr/cas系统。cas蛋白包括例如cas1、cas2、cas3、cas4、csn2、cas7、cas8、cas9、cas10、cas11、cas12、cas12a(cpf1)、cas13或cas14蛋白。在一些实施方案中，本发明使用的crispr/cas系统为属于ii型系统的crispr/cas9系统。crispr/cas9系统用于基因编辑中，其中靶向序列与目标基因的dna序列特异性结合，引导cas9核酸酶切割dna双链，并激活非同源末端连接，达到基因修饰的目的。
83、根据现有技术记载，靶向cd5的car-t细胞存在一定程度的自相残杀情况，t细胞的自相残杀限制了car-t细胞的生存能力，导致其在患者体内的存续时间有限。为了解决这一问题，本发明使用crispr/cas9基因编辑技术使car-t细胞上的cd5抗原表达降低。本发明提供的crispr/cas9基因编辑系统使用的试剂包含靶向细胞内源性cd5基因的grna或用于表达所述grna的表达载体。在一些实施方案中，本发明提供的crispr/cas9系统使用的试剂包含靶向细胞内源性cd5基因的grna或用于表达所述grna的表达载体，以及cas9蛋白或其功能性变体、或表达所述cas9蛋白或其功能性变体的表达载体。
84、在一些实施方案中，本发明提供的grna包括crrna和tracrrna，其中crrna由间隔序列和附加序列组成。本发明提供的grna包含的附加序列和tracrrna序列是本领域所熟知的，例如wo2017093969a中记载的序列，具体例如，附加序列为
85、guuuuagagcuaugcu，tracrrna序列为
86、agcauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccga gucggugcuuu。
87、pam序列包括ngg、nag、ngn、nngrrt、nnnrrt、nnagaaw、nggng、nnnngatt、nnnnacac、nnnnryac、ngan、ngng，ngag、ttn、tttn或ngcg，其中n是任意核酸碱基，r是嘌呤，y是嘧啶。在一些实施方案中，本发明所使用的crispr/cas9系统涉及的pam序列如表1中所示。
88、本发明提供的crispr/cas9基因编辑系统搭配适合的grna具有较好的细胞内源性cd5基因敲除效率，能使靶向cd5的car-t细胞的自杀率降至最低程度，同时不影响car-t细胞的扩增，维持其在患者体内的存续时间以及杀伤能力。
89、根据本公开的第七方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明第五方面公开的内源性cd5基因修饰的细胞，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或载体。
90、赋形剂和/或载体通常也称为辅料。药学上可接受的载体是指药剂学可接受的载体(carrier)，与基因工程中用于插入核酸的载体(vector)通常并不是同一物质。本领域技术人员能够意识到，药学上可接受的赋形剂和/或载体在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒或基本上无毒，在药理学和/或生理学上和本发明的活性成分相容，例如不影响其存活力或功效。在一些实施方案中，药物组合物可含有用于改善、维持或保留例如组合物的ph、渗透性、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、释放速率、吸收或渗透的物质。可视预期的施用途径、递送方式和所需的剂量来确定最佳的药物组合物。药学上可接受的赋形剂和/或载体的示例描述于remington和gennaro，remington’s pharmaceuticalsciences(第18版，1990)中。药学上可接受的赋形剂和/或载体是指任何赋形剂、填充剂、盐、稳定剂、增溶剂、油脂、脂质、含脂质的囊泡、微球体、脂质体封装、吸附剂、抗氧化剂、溶剂、共溶剂、缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、润湿剂、乳化剂、包覆剂、等渗剂、吸收延迟剂、张力调节剂、稀释剂、防腐剂和/或佐剂。在一些实施方案中，本发明可以使用的赋形剂和/或载体包括但不限于：水、盐溶液、缓冲液、葡萄糖、甘油、乙醇、多元醇中的一种或多种。
91、本发明的药物组合物可以以例如无菌制剂的形式提供。无菌制剂的形式例如等渗水溶液、悬浊液、乳浊液、分散液等。药物组合物的溶剂或介质可以是水、乙醇或多元醇中的一种或几种。本发明可以通过例如无菌过滤膜过滤的方式使药物组合物无菌。在组合物冻干时，可在冻干、复溶、稀释之前或之后使用此方法进行灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以冻干形式或在溶液中储存。可以通过例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。本发明的药物组合物可以以本领域技术人员显而易见的其他形式提供，例如可以作为缓释或控释组合物提供。用于制备缓释或控释药物的技术(如脂质体载剂、生物易蚀微粒、多孔珠粒或积存注射)也为本领域技术人员所公知。例如注射用组合物的延长吸收可通过在组合物中包含延缓吸收的辅料如单硬脂酸或明胶来实现。药物组合物可以以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、粘性组合物、固体、晶体或以冻干粉末的形式储存于无菌小瓶中。所述药物组合物可储存成即用形式或在施用前复溶经处理使用的形式。本发明的药物组合物的制备方法是本领域技术人员显而易见的。
92、本发明的药物组合物可以以任何方便的方式使用，包括通过喷雾、注射、吞咽、输液、植入或移植。本发明的药物组合物可通过例如经口、经鼻、通过静脉内、腹膜内、脑内(脑实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内、门静脉或病灶内途径注射，还可以通过持续释放系统或通过植入装置进行施用。在一些实施方案中，本发明的药物组合物通过胃肠外完成施用。胃肠外递送方法包括局部、动脉内、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内、子宫内、阴道内、舌下或鼻内施用。
93、施用包含本发明的内源性cd5基因修饰的细胞的药物组合物的治疗有效量将取决于例如治疗程度和目标。本领域技术人员知晓，用于治疗的合适的剂量水平将部分取决于所递送的分子、适应症、施用途径和患者情况(体重、体表或器官大小)和/或状况(年龄和一般健康状况)。在一些实施方案中，临床医生可调整剂量并改变施用途径来获得最佳的治疗效果。
94、给药频率将取决于本发明的药物组合物的药物动力学参数。临床医生通常施用药物组合物直到达到实现所需效果的剂量。因此，药物组合物可作为单剂量施用，或随时间以两次或多剂量(可含有或不含有相同量的所需分子)施用，或通过植入装置或导管以连续输液的方式施用。
95、根据本公开的第八方面，本发明提供一种如本公开第五方面所述的内源性cd5基因修饰的细胞或如本公开第七方面所述的药物组合物在制备用于诊断、预防和/或治疗疾病或病症的药物中的用途。
96、在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的细胞或包含所述细胞的药物组合物在制备用于诊断、预防和/或治疗疾病或病症的药物中的用途，其中所述疾病或病症包括与cd5表达相关的疾病或病症。
97、在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的细胞或包含所述细胞的药物组合物在制备用于诊断、预防和/或治疗疾病或病症的药物中的用途，其中所述疾病或病症包括与cd5表达相关的癌症或肿瘤。
98、在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的细胞或包含所述细胞的药物组合物在制备用于诊断、预防和/或治疗疾病或病症的药物中的用途，其中所述疾病或病症包括与cd5表达相关的恶性t细胞肿瘤或恶性b细胞肿瘤。
99、在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的细胞或包含所述细胞的药物组合物在制备用于诊断、预防和/或治疗疾病或病症的药物中的用途，其中所述疾病或病症包括t细胞白血病、t细胞淋巴瘤或b细胞淋巴瘤。
100、在一些实施方案中，本发明提供的内源性cd5基因修饰的细胞或包含所述细胞的药物组合物在制备用于诊断、预防和/或治疗疾病或病症的药物中的用途，其中所述疾病或病症包括急性t淋巴细胞白血病、急性t淋巴细胞淋巴瘤、t淋巴母细胞瘤、外周t细胞淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤或弥漫性大b细胞淋巴瘤。
101、本发明的内源性cd5基因修饰的细胞可以与其他药物组合使用。在组合用药时，所述细胞和其他药物可以同时施用或在不同时间施用，例如在短期内先后施用。细胞和试剂可以混合或以单独的包装或剂型存在。组合用药可以在相同的治疗过程中施用，例如在用抗cd5免疫疗法治疗受试者的过程中，可以同时或顺序地(例如，在用抗cd5免疫疗法治疗之前、期间或之后)向受试者施用有效量的本发明的细胞。
102、本发明所应用的crispr/cas系统中，grna的设计需要考虑很多因素，例如长度、碱基组成、靶基因的结合位置、与非靶标位点的结合率、是否包含snp、二级结构等等。目前已经可以通过各种在线工具来设计grna。然而，由于cas蛋白可以切割任何邻近pam位点的靶序列，针对特定的靶基因而言，在线工具设计的大量grna的编辑效率都不尽相同，甚至差异很大。因此，筛选特异性高的grna对于crispr/cas系统编辑效率的提高至关重要。本发明的grna经过大量筛选并经过细胞内源性基因敲除率的验证，具备较好的基因编辑效率，经基因修饰后的细胞与野生型细胞(内源性cd5基因未经基因修饰而正常表达cd5抗原的对照细胞)相比，cd5抗原的表达率显著降低。
103、本发明公开的内源性cd5基因修饰的细胞或包含这些细胞的药物组合物，可以施用于患有肿瘤细胞上表达cd5抗原的恶性肿瘤疾病的患者。这些患者是靶向cd5抗原的免疫疗法的合适的受试者，但由于免疫疗法存在不利的脱靶风险，导致服药的风险大于获益，使得患者无法正常用药。本发明的基因修饰方法能够使相关施用细胞上的cd5抗原表达降低，因此，施用本发明的内源性cd5基因修饰的细胞或包含这些细胞的药物组合物，能够改善免疫疗法的脱靶风险，因为靶向cd5的免疫治疗药物无法有效的靶向本发明的细胞。
104、在向受试者施用靶向cd5的细胞疗法如car-t细胞疗法时，由于car-t细胞表面表达靶向cd5的car，同时一部分car-t细胞表面还表达cd5抗原，因此导致car-t细胞之间的“自相残杀”会影响该疗法的有效性，故可能存在这种风险：在实现期望的临床结果(如患者体内表达cd5的恶性细胞被消除)之前，大部分或所有car-t效应细胞均已因“自相残杀”被消除。而施用本发明的内源性cd5基因修饰的细胞，例如cd5抗原表达被降低的car-t细胞作为细胞疗法中的免疫效应细胞，能够消弭这种“自相残杀”现象及其对治疗效果带来的负面影响。
105、crispr/cas系统可以通过本领域已知的任何方法递送进入细胞，例如，通过用编码cas蛋白和grna的质粒转染将所述系统直接应用于人细胞、使用病毒载体递送或物理方式递送。在体细胞基因治疗中通常选择腺病毒载体(aav)用于体内基因递送。crispr/cas系统的递送的病毒载体可以选自腺病毒、慢病毒和噬菌体；非病毒载体可以选自脂质体如lipofectaminetm、聚合物和金纳米颗粒。crispr/cas基因编辑系统递送的物理方法可以选自电穿孔法、显微注射法等。电穿孔技术能够通过将电场施加到细胞上以增加细胞膜的渗透性，从而允许将化学物质、药物、dna、rna或蛋白质引入细胞。并且由于病毒(包括慢病毒、逆转录病毒或腺病毒)转导t细胞的效率较低，且其存在与crispr/cas的延长表达相关的毒性，因此，电穿孔法已作为一种高效率、低毒性的递送方法应用于crispr/cas系统的递送中。
106、grna可通过化学合成和/或通过酶促合成。例如，grna可使用基于亚磷酰胺的标准固相合成方法合成。或者，通过将编码grna的dna可操作地连接至被噬菌体、rna聚合酶识别的启动子控制序列，可在体外合成grna。合适的噬菌体启动子序列的示例包括t7、t3、sp6启动子序列，或其变体。
107、grna可以通过pcr扩增或构建质粒表达。使用质粒表达可以将编码grna的核酸对退火并连接到质粒中，并转化至感受态细胞。例如，将grna克隆到质粒例如pspcas9(bb)中，再转化到感受态大肠杆菌菌株。
108、grna可以作为rna分子被引入细胞内。例如，rna分子可以是体外转录的和/或可以是化学合成的；rna可以从合成的dna分子(例如，基因片段)转录而来，然后，grna可以作为rna分子被引入细胞内。grna也可以以非rna核酸分子(例如，dna分子)的形式被引入细胞内。例如，可以将编码grna的dna可操作地链接至启动子控制序列，以在目标细胞内进行grna的表达。可以将rna编码序列可操作地连接至被rna聚合酶iii(pol iii)识别的启动子序列。可用于表达grna的质粒载体包括但不限于，px330载体和px333载体。在一些实施方案中，质粒载体(例如，px333载体)可包含至少两个编码grna的dna序列。
109、本发明的grna可以以任何合适的方式递送到细胞。包括用于递送crispr/cas系统的方法，例如，通过电穿孔的方式将grna复合物导入细胞中、将编码cas核酸酶和grna的mrna电穿孔递送到细胞中、或者通过病毒载体递送编码rna或dna，例如通过逆转录病毒(例如慢病毒)载体递送。在一些实施方案中，将靶细胞分别与cas核酸酶和grna接触，并在细胞内形成grna复合物。在一些实施方案中，使靶细胞与编码cas核酸酶和/或grna的核酸接触，例如dna或rna。在一些实施方案中，将靶细胞与grna复合物接触。
110、cas9核酸酶识别crispr重复序列中的短基序或前间区序列邻近基序(pam)以帮助区分自我与非自我。cas9核酸酶序列和结构是本领域技术人员所公知的。cas9直系同源物已经在多种物种中描述，例如包括酿脓链球菌和嗜热链球菌。基于本公开，其他合适的cas9核酸酶和序列对于本领域技术人员而言是显而易见的。
111、可采用本领域常规的方法制备本发明的单链抗体、单域抗体或重链抗体，例如本领域熟知的噬菌体展示技术。或者，本发明的各种抗体可在其他细胞系中表达。可用编码本发明各抗体的序列转化合适的哺乳动物宿主细胞。转化可采用任何已知的方法进行，例如包括将多核苷酸包装在病毒(或病毒载体中)并用病毒(或载体)转导宿主细胞。所用的转化程序取决于将转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法为本领域所熟知，包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸包封在脂质体中和将dna直接微注射至核中等。可用于表达的宿主哺乳动物细胞系为本领域所熟知，例如可从美国典型培养物保藏中心(atcc)获得的多种永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(cho)细胞、hela细胞、幼仓鼠肾(bhk)细胞、猴肾细胞(cos)、人肝细胞癌(hepg2)细胞等。
112、可采用本领域常规的方法制备本发明的嵌合抗原受体，可参见例如park et al,trends bio technol.,29:550-557,2011；grupp et al,n engl j med.,368:1509-1518,2013；han et al,j.hematol.oncol.,6:47,2013。
113、本发明的单链抗体、单域抗体、重链抗体或嵌合抗原受体的核酸全长序列或其片段可以用常规技术获得，例如通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。用人工合成的方法来合成有关序列是一种可行的方法，尤其是对于片段长度较短的序列。通常，可以通过先合成多个小片段，然后再进行连接以获得序列较长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6his)融合在一起，形成融合蛋白。
114、一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、多肽等)包括以分离的形式存在的生物分子。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(或载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的多肽序列中。
115、病毒载体技术是本领域熟知的，并且在sambrook等人的molecular cloning:alaboratory manual.cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor.(2001)([分子克隆：实验室手册]，纽约冷泉港的冷泉港实验室，2001年)以及其他病毒学和分子生物学手册中有记载。
116、现有技术中已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。可以使用本领域已知的技术将异源核酸插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以在体外或离体分离重组病毒并将其递送至工程化哺乳动物细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一些实施方案中，使用慢病毒载体。使用本领域已知的方法，所得慢病毒载体可用于转导哺乳动物细胞(例如原代人t细胞)。在一些实施方案中，使用自灭活慢病毒载体。例如，携带免疫调节剂(例如免疫检查点抑制剂)编码序列的自灭活慢病毒载体和/或携带嵌合抗原受体的自灭活慢病毒载体可以用本领域已知的方案包装。
117、用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤为本领域所熟知。另一种方法是使用mgcl2。此外，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射法、电穿孔法，脂质体转染法等。
118、获得的转化子可以用常规方法培养，以表达本发明的核酸分子所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
119、在上述方法中的多肽或蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的多肽或蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术以及这些方法的结合。
120、采用本领域已知的常规方法(如通过转染、转导、转化等)可以将编码嵌合抗原受体的核酸序列引入免疫效应细胞。
121、将载体或分离的核酸引入免疫效应细胞的方法是本领域已知的。所描述的载体可以通过物理、化学或生物学方法转移到免疫效应细胞中。
122、将载体引入免疫效应细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于制备包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域众所公知的，并且在例如sambrook,j.,fritsch,e.f.and maniatis,t.(2001)molecular cloning:alaboratory manual.cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor.以及其他病毒学和分子生物学手册中有记载。在一些实施方案中，通过电穿孔方法将载体引入免疫效应细胞中。
123、将载体引入免疫效应细胞的生物学方法包括使用dna和rna载体。病毒载体已成为将基因插入哺乳动物细胞(例如人类细胞)中最广泛使用的方法。
124、将载体引入免疫效应细胞的化学方法包括胶体分散系统，例如包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和基于脂质的体系，例如包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外递送载体的示例性胶体系统是脂质体。
125、在一些实施方案中，编码本文所述的任何嵌合抗原受体的核酸分子可以通过常规方法(例如体外转录)制备，然后通过已知方法例如mrna电穿孔引入免疫效应细胞(参见peter mrabinovich.human gene therapy,17:1027-1035(2006))。
126、在一些实施方案中，经转导或转染的免疫效应细胞在引入载体或分离的核酸后进行离体培养增殖。在一些实施方案中，培养转导或转染的免疫效应细胞以增殖至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或14天。
127、术语解释
128、除非另有说明，否则本文中所使用的所有术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解的相同。
129、本发明所用术语“基因编辑”(gene editing)是指在活体基因中，使用基因编辑系统作为工具，对基因进行定点修饰，从而实现对特定的基因序列的剪切删除、插入或单个碱基的突变等。基因编辑系统是指至少包含核酸酶(或核酸酶结构域)和可编码核酸结合结构域的一个或多个分子的系统，所述核酸酶和所述可编码核酸结合结构域是必需的，并且足以通过核酸酶(或者核酸酶结构域)在靶向序列上引导并实现对核酸的修饰(例如，靶向序列上单链或双链断裂)。传统的基因编辑可以总结为3个步骤：基因编辑工具的定位、通过核酸酶介导的dna损伤(一般会产生dna双链断裂)以及通过细胞内dna损伤修复机制例如同源定向修复(hdr)或非同源末端连接(nhej)介导的dna修复，达到基因组删除、插入、基因点突变的目的。基因编辑系统包括：例如锌指核酸酶(zinc finger nucleases，zfns)、转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator like effector nucleases，talens)、规律性重复短回文序列簇(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/crispr-associated protein)，这些系统可以对基因组进行高效靶向修饰，通过在基因组的特定位置添加、去除或改变遗传物质来进行修饰。基因编辑是修饰基因组的核苷酸序列的过程，在一些实施方案中，本发明的基因编辑方法，通过使用crispr/cas系统修饰细胞的内源性基因，实现降低或消除细胞上一种或多种抗原的表达。使用crispr/cas9系统进行基因编辑是本领域公知的，例如ran,f.,hsu,p.,wright,j.et al.genomeengineering using the crispr-cas9 system.nat protoc 8,2281–2308(2013).
130、本发明所用术语“crispr系统”、“cas系统”或“crispr/cas系统”，包括向导rna分子(grna)和grna引导的核酸酶或其他效应分子。crispr系统可以包括grna和cas蛋白，例如cas9蛋白。grna和cas蛋白可以形成核糖核酸蛋白(rnp)复合物。其中cas蛋白具有切割dna双链的功能，grna起引导作用，在原间隔序列相邻基序(pam)存在的情况下，cas9蛋白可以在grna的引导作用下到达不同的靶部位，切割靶基因，实现dna双链断裂，并激活非同源末端连接(nhej)，或通过同源定向修复(hdr)机制创建外源供体dna可能插入的位点。nhej修复途径是活性最高的修复途径，能够频繁地在双链断裂(dsb)位点处造成小核苷酸插入或缺失(插入缺失)。nhej介导的dsb修复的随机性具有重要的实践意义，在大多数情形中，nhej在靶向dna中产生小的插入缺失，进而导致氨基酸缺失、插入或框移突变。理想的效果是靶向基因的功能丧失或突变。
131、crispr-cas系统包括两类，第1类可以使用多个cas蛋白形成的复合物切割外源核酸的效应因子，第2类可以使用单一的大cas蛋白用于切割外源核酸的效应因子。1类可分为i型、iii型和iv型，2类可分为ii型、v型和vi型。这6种系统类型可进一步划分为19个亚型。
132、cas蛋白的非限制性示例包括cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas5d、cas5t、cas5h、cas5a、cas6、cas7、cas8、cas9(也称为csn1或csx12)、cas10、csy1、csy2、csy3、csy4、cse1、cse2、cse3、cse4、cse5e、csc1、csc2、csa5、csn1、csn2、csm1、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx1s、csf1、csf2、cso、csf4、csd1、csd2、cst1、cst2、csh1、csh2、csa1、csa2、csa3、csa4、csa5、cas12a/cpf1、cas12b/c2c1、cas12c/c2c3、cas12d/casy、cas12e/casx、cas12g、cas12h、cas12i、和cas12j/casφ、carf、ding、其同源物、或其经修饰的版本。未修饰的cas蛋白可具有dna切割活性。cas蛋白可引导靶向序列的一条或两条链的切割，诸如在靶向序列内和/或在靶向序列的互补序列内。例如，cas蛋白可引导从靶向序列的第一个或最后一个核苷酸起约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500或更多个碱基对内的一条或两条链的切割。在一些实施方案中，cas9是经修饰的cas9。cas9通过两个核酸酶结构域ruvc和hnh的组合活性产生dsb。
133、cas蛋白可以是从化脓性链球菌(streptococcus pyogenes cas9,spcas9)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus cas9,sacas9)、嗜热链球菌(streptococcusthermophilus cas9,stcas9)、脑膜炎奈瑟球菌(neisseria meningitidis cas9,nmcas9)、新弗朗西斯菌(francisella novicida cas9,fncas9)或空肠弯曲杆菌(campylobacterjejuni cas9,cjcas9)中分离得到的相应cas蛋白。在一些实施方案中，cas蛋白是来源于野生型cas蛋白的cas变体。示例性的cas变体可以是高保真度的cas9蛋白。在一些实施方案中，cas9是变体cas9蛋白。变体cas9多肽的氨基酸序列相比野生型cas9蛋白的氨基酸序列有至少一个氨基酸不同(例如，具有缺失、插入、置换、融合)。在一些实施方案中，cas蛋白变体相比野生型cas9蛋白的氨基酸序列有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个氨基酸不同。在一些实例中，变体cas9蛋白具有氨基酸变化(例如，缺失、插入或置换)，该变化降低cas9蛋白的核酸酶活性。例如，在一些实例中，变体cas9蛋白具有低于50％、低于40％、低于30％、低于20％、低于10％、低于5％、或低于1％的对应野生型cas9蛋白的核酸酶活性。在一些实施方案中，变体cas9蛋白基本上没有核酸酶活性。当cas9蛋白是基本上没有核酸酶活性的变体cas9蛋白时，它可以被称为“dcas9”。在一些实施方案中，cas变体可以与另一种酶融合，例如活化诱导的胞苷脱氨酶(aid)。在自然界，dna结合和切割通常需要蛋白质和两种rna。但是，单向导rna可以经工程改造以将多种crrna和tracrrna并入单一rna物质中。参见，例如，jinek m.等人,science 337:816-821(2012)。在一些实施方案中，cas蛋白或grna复合物可以与用于同源定向修复(hdr)的模板一起施用。在一些实施方案中，cas蛋白或grna复合物在没有hdr模板的情况下施用。
134、“grna”或“向导rna”是指一种合成或重组的多核苷酸，其对于目标结构域的序列具有特异性。grna可以靶向结构域的任何外显子或内含子。在一些实施方案中，grna可包含修饰。修饰可以在grna的任何位置。可以对单一的grna进行多于一个的修饰。grna的修饰可以是置换、插入、缺失、化学修饰、物理修饰、稳定化、纯化或其任意组合。grna可在修饰后进行质量控制。在一些实施方案中，质量控制可包括page、hplc、ms或其任意组合。
135、本发明所用术语“前间区序列邻近基序(pam)”或“pam样基序”是指紧随在由crispr系统中cas蛋白靶向的靶向序列下游的2至6个碱基对。pam序列可以位于切割位点下游3-4个核酸处。pam序列对于靶标结合至关重要，cas蛋白需要pam序列来识别靶向序列。在grna与靶向序列配对后，cas蛋白介导pam上游约3nt的双链断裂。pam序列可以是本领域中已知的任何pam序列。合适的pam序列包括但不限于，ngg、nga、ngc、nag、ngn、ngt、ngtt、ngcg、ngag、ngan、ngng、ngcn、ngtn、nngrrt、nnnrrt、nggng、nngrr(n)、tttv、tycv、tatv、nnnngatt、nnagaaw或naaaa，其中n是任意核酸碱基，r是嘌呤，y是嘧啶，w是a或t。例如，cas9的pam序列可以是ngg，例如，来自酿脓链球菌的cas9蛋白(spcas9)，其需要标准的ngg序列作为pam序列以结合特定的核酸区域，“ngg”中的“n”可以是腺嘌呤(a)、胸腺嘧啶(t)、鸟嘌呤(g)或胞嘧啶(c)，并且g是鸟嘌呤。在一些实施方案中，cas蛋白被工程化/修饰以识别一种或多种pam序列。在一些实施方案中，cas蛋白被工程化/修饰，以识别与cas蛋白未经工程化/修饰时识别的pam序列不同的一个或多个pam序列，例如，cas变体可以识别修改后的pam序列，如ngg、ngan、ngng、ngag、ngcg、nng、tttn、ytn或yg。
136、“免疫效应细胞”是指可以执行免疫效应功能(例如细胞毒性细胞杀伤活性、分泌细胞因子、诱导adcc和/或cdc)的免疫细胞。例如，免疫效应细胞可以是t细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、nk细胞和/或nkt细胞，或者是衍生自干细胞，例如成体干细胞、胚胎干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞等的免疫细胞。当免疫效应细胞是t细胞时，t细胞可以是任何t细胞，如体外培养的t细胞，例如原代t细胞，或者来自体外培养的t细胞系例如jurkat、supt1等的t细胞，或获得自受试者的t细胞。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。t细胞可以从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织及肿瘤。t细胞也可以被浓缩或纯化。t细胞可以处于任何发育阶段，包括但不限于，cd4+/cd8+t细胞、cd4+辅助t细胞(例如th1和th2细胞)、cd8+t细胞(例如细胞毒性t细胞)、cd4-/cd8-t细胞、肿瘤浸润细胞、记忆t细胞、幼稚t细胞、γδ-t细胞、αβ-t细胞等。
137、本发明所用术语“来源于”表示两者之间的关系，通常是指两者之间的结构相似性。例如，在来源于cd3ζ的细胞内信号传导结构域的情况下，细胞内信号传导结构域保留足够的cd3ζ结构，使得其具有所需的功能，即在适当条件下产生信号的能力。它没有暗示或包括对产生细胞内信号传导结构域的特定过程的限制，例如，它并不意指为了提供细胞内信号传导结构域，必须从cd3ζ序列开始并删除不需要的序列，或强加突变，以到达细胞内信号传导结构域。
138、本发明所用术语“抗体”是指源自免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列，所述蛋白质或多肽序列与抗原(如靶抗原)特异性结合。抗体可以是来源于天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，也可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体的非限制性实例包括单克隆抗体(包括完整抗体)、单域抗体(sdab)、单链抗体(scfv)、重链抗体(hcab)、重链单域抗体(vhh)、轻链抗体(lcab)、单价抗体，“抗体”还包括能够表现期望的生物活性的携带一个或多个cdr序列的抗体片段或合成多肽，尤其是抗原结合片段，例如fab，f(ab’)2和fv。在本发明一些实施例中，术语“免疫球蛋白(ig)”和“抗体”可互换地使用。抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别称为“vh”和“vl”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分(相对于相同类型的其它抗体)并含有抗原结合位点。
139、本发明所用术语“抗原”或“ag”是指引起免疫应答的分子。免疫应答可以涉及抗体的产生或特定免疫活性细胞的活化，或两者皆有。本领域技术人员能够理解实际上包括所有蛋白质或肽的任何大分子都可以作为抗原。此外，抗原可以源自重组或基因组dna。本领域技术人员能够理解包含编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何dna都因此编码“抗原”。抗原可以通过合成产生，或可以源自生物样品，或者可以是除多肽外的大分子。这样的生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其他生物组分的细胞或液体。
140、本发明所用术语“抗原结合片段”或“抗体片段”，是指包含完整抗体或其重组变体的至少一部分，一般包含完整抗体的抗原结合位点并因此保留结合抗原的能力。抗体片段的实例包括但不限于：fab、单链抗体(scfv)、单域抗体(sdab)、抗体的重链可变区(vh)、重链抗体(hcab)、重链单域抗体(vhh)、轻链抗体(lcab)、线性抗体、抗原的天然配体或其功能性片段等。
141、本发明所用术语“功能性片段”或“功能性变体”是指基本上包含亲本的氨基酸序列但与该亲本氨基酸序列相比含有至少一个氨基酸修饰(例如取代、缺失或插入)的变体，条件是所述变体保留亲本氨基酸序列的生物活性。在一些实施方案中，所述氨基酸修饰是保守型修饰。
142、本发明所用术语“重链抗体”是源自骆驼科生物或软骨鱼科生物的抗体。相比4链抗体，重链抗体缺失轻链和重链恒定区1(ch1)，仅包含2条由可变区(vhh)和其他恒定区组成重链，可变区通过类似铰链区结构与恒定区相连。骆驼科重链抗体的每条重链包含1个可变区(vhh)和2个恒定区(ch2和ch3)，软骨鱼科重链抗体的每条重链含有1个可变区和5个恒定区(ch1-ch5)。重链抗体的抗原结合片段包括vhh和单链重链抗体。通过与人igg fc的恒定区融合，重链抗体可以具有人igg fc的ch2和ch3。
143、单域抗体(sdab)可以具有相同或不同的来源，并且具有相同或不同的大小。示例性的sdab包括但不限于来自仅重链抗体的重链可变结构域(例如vhh)、天然没有轻链的结合分子、单结构域(例如vh或vl)衍生自常规4链抗体、由表达人类重链片段的转基因小鼠或大鼠产生的人类单域抗体，以及非衍生自抗体的工程域和单域支架。本领域已知的或由本发明公开的任何sdab，包括本发明公开的单域抗体，可用作本发明所述的嵌合抗原受体中的细胞抗原结合结构域。sdab可以来源于任何物种，包括但不限于小鼠、大鼠、人、骆驼、美洲驼、七鳃鳗、鲨鱼、山羊、兔和牛。本发明的单域抗体还包括来自骆驼科和鲨鱼以外的物种的天然存在的单域抗体分子。
144、“抗原结合结构域”是指嵌合抗原受体的与靶抗原特异性结合的部分，嵌合抗原受体可以利用其抗原结合特性将t细胞和/或其他免疫细胞定向至所选择的靶标。抗原结合结构域可以典型地包含抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)，但是其不必同时包含这两个可变区。例如，可包括具有抗原结合活性的fab片段，fab’片段、单一fv片段例如scfv、单域抗体等。
145、“跨膜结构域”是用于连接嵌合抗原受体的细胞外结构域和细胞内结构域。跨膜结构域可以是天然或合成的，也可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜结构域的非限制性实例包括，tcrα、tcrβ、tcrγ、tcrδ、tcrζ、cd28、cd3ζ、cd3ε、cd3γ、cd3δ、cd45、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd152、cd154、ox40、icos、lag-3、2b4、btla、ctla-4、pd-1。
146、“胞内信号传导结构域”是指蛋白质的功能性部分，即足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的功能性部分。胞内信号传导结构域负责在抗原结合区结合抗原以后的细胞内初级信号传递，从而导致免疫细胞和免疫反应的活化。换言之，胞内信号传导结构域负责活化其中表达car的免疫细胞的正常的效应子功能的至少一种。例如，t细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含的胞内信号传导结构域可以是t细胞受体和共受体的细胞质序列，其在抗原受体结合以后一同起作用以引发信号传导，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同或相似功能的任何合成序列。胞内信号传导结构域可以包含许多免疫受体酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs,itam)。胞内信号传导结构域的非限制性实例包括但不限于fcrγ、fcrβ、tcrζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd5、cd22、cd79a、cd79b、cd278(icos)、fcεri、dap10、dap12或cd66d。
147、“铰链区”是指用于连接跨膜结构域和抗原结合结构域的任何寡肽或多肽。具体地，铰链区用来为抗原结合结构域提供更大的灵活性和可及性。铰链区可以包含最多达300个氨基酸，优选10至100个氨基酸并且最优选25至50个氨基酸。铰链区可以全部或部分源自天然分子，例如全部或部分源自cd8或cd28的胞外区，或全部或部分源自抗体恒定区。或者，铰链区可以是对应于天然存在的铰链序列的合成序列，或可以是完全合成的铰链序列。
148、car的不同结构域也可以通过肽接头相互融合。这取决于单域抗体和/或各种域的结构和/或功能特征，car中的每个肽接头可以具有相同或不同的长度和/或序列。本领域技术人员可以独立地选择和优化每个肽接头。
149、肽接头可以具有任何合适的长度。在一些实施方案中，肽接头的长度为约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约10个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约50个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸、或约1个氨基酸至约100个氨基酸。
150、肽接头可以具有天然存在的序列或非天然存在的序列。例如，源自仅重链抗体的铰链区的序列可以用作接头。参见，例如wo1996/34103。在一些实施方案中，肽接头是柔性接头。示例性柔性接头包括但不限于甘氨酸聚合物(g)n，甘氨酸-丝氨酸聚合物(例如(gs)n、(gsg)n、(gggs)n和(ggggs)n，其中n是至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其他柔性接头。
151、“共刺激信号结构域”可以是来自共刺激分子的细胞内功能性信号传导结构域，其包含所述共刺激分子的整个细胞内部分，或其功能片段。“共刺激分子”是指在t细胞上与共刺激配体特异性结合，由此介导t细胞的共刺激反应(例如增殖)的同源结合配偶体。共刺激结构域的非限制性实例包括但不限于以下蛋白质的胞内区：mhc i类分子、tnf受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(slam蛋白)、激活性nk细胞受体、tlr1-10、card11、cd134(ox40)、cd2、cd3、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd83、cds、icam、cd137(4-1bb)、cd276(b7-h3)、cd278(icos)或它们的任何组合。
152、“信号肽”可以使得嵌合抗原受体在细胞(例如t细胞)中表达时，使新生蛋白质被引导至内质网并随后引导至细胞表面。通常，信号肽的核心可以含有长的疏水性氨基酸区段，其具有形成单个α-螺旋的倾向。信号肽指导翻译的蛋白质穿过膜的转运和/或分泌。在信号肽的末端，通常有被信号肽酶识别和切割的氨基酸区段。信号肽酶可以在移位期间或完成后切割，以产生游离信号肽和成熟蛋白。然后，游离信号肽被特定蛋白酶消化。信号肽也可以被称为靶向信号、转运肽、定位信号或信号序列。例如，信号序列可以是共翻译或翻译后信号肽。
153、本发明所用术语“患者”、“受试者”、“个体”、“对象”在本文中可互换使用，包括任何生物体，优选动物，更优选哺乳动物(例如大鼠、小鼠、狗、猫、兔等)，且最优选的是人。
154、“治疗”指向受试者采用本发明所述治疗方法以达到至少一种阳性治疗效果(例如癌细胞数目减少、肿瘤体积减小、癌细胞浸润至周边器官的速率降低或肿瘤转移或肿瘤生长的速率降低)。有效治疗患者的治疗方法可根据多种因素(例如患者的疾病状态、年龄、体重以及疗法激发受试者的抗癌反应能力)调整。
1.一种修饰细胞内源性cd5基因的方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述cd5抗原的表达在所述经基因修饰的细胞中减少至少50％、减少至少60％或减少至少70％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述细胞为免疫效应细胞；优选的，所述免疫效应细胞可以选自t细胞、b细胞、nk细胞、巨噬细胞、树突状细胞、由诱导性多能干细胞(ipsc)分化而成的免疫效应细胞或它们的任何组合。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在将所述试剂引入待基因修饰的细胞之前进行配制试剂的步骤，所述步骤包括：将crrna和tracrrna混合以形成grna复合物，以及将grna复合物与cas9蛋白混合，从而得到所述试剂。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在将试剂引入待基因修饰的细胞之前或之后将包含表达能够特异性识别抗原的靶向配体的核酸分子的载体转导进入细胞的步骤；优选的，其中所述能够特异性识别抗原的靶向配体可以选自嵌合抗原受体(car)、t细胞抗原受体(tcr)或b细胞抗原受体(bcr)；或优选的，其中所述载体可以选自慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
6.一种靶向细胞内源性cd5基因的grna，其特征在于，所述grna包含间隔序列，所述间隔序列为如seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12或seq id no:17任一所示的核酸序列。
7.一种用于制备内源性cd5基因修饰的细胞的试剂，其特征在于，所述试剂包含：(i)靶向细胞内源性cd5基因的grna或用于表达所述grna的表达载体，其中所述grna包含间隔序列，所述间隔序列为选自seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12或seqid no:17任一所示的核酸序列，和(ii)cas9蛋白或其功能性变体、或表达所述cas9蛋白或其功能性变体的表达载体。
8.一种内源性cd5基因修饰的细胞，其特征在于，所述细胞为由权利要求1-5中任一项所述的方法制备得到，使得cd5抗原表达在所述细胞中减少至少50％、减少至少60％或减少至少70％；优选的，所述细胞还包含能够特异性识别抗原的靶向配体，所述能够特异性识别抗原的靶向配体可以选自嵌合抗原受体(car)、t细胞抗原受体(tcr)或b细胞抗原受体(bcr)，进一步优选的，所述嵌合抗原受体(car)包含能够特异性识别cd5抗原的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞内信号传导结构域，更进一步优选的，所述能够特异性识别cd5抗原的细胞外抗原结合结构域包含特异性识别cd5抗原的单链抗体(scfv)、单域抗体(sdab)或重链抗体(hcab)；或优选的，所述细胞为免疫效应细胞，所述免疫效应细胞可以选自t细胞、b细胞、nk细胞、巨噬细胞、树突状细胞、由诱导性多能干细胞(ipsc)分化而成的免疫效应细胞或它们的任何组合。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求8所述的细胞，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或载体。
10.一种如权利要求8所述的细胞，或权利要求9所述的药物组合物在制备用于诊断、预防和/或治疗与cd5表达相关的疾病或病症的药物中的用途；优选的，所述与cd5表达相关的疾病或病症包括t细胞白血病、t细胞淋巴瘤或b细胞淋巴瘤；或优选的，所述与cd5表达相关的疾病或病症包括急性t淋巴细胞白血病、急性t淋巴细胞淋巴瘤、t淋巴母细胞瘤、外周t细胞淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤或弥漫性大b细胞淋巴瘤。
