本发明涉及类固醇激素检测，具体涉及一种基于lc-ms/ms同时检测干血斑中多种类固醇激素的试剂盒及其应用。
背景技术：
1、类固醇激素对人体新陈代谢、生长、发育及生殖行为、维持内环境稳定等方面起着重要的调节作用。
2、先天性肾上腺皮质增生症(congenital adrenal hyperplasia，cah)，这是一种由于类固醇激素合成代谢中某种酶缺乏导致皮质醇合成障碍为主要特征的常染色体隐性遗传性疾病。cah根据酶缺乏分成6型，21-羟化酶缺乏症(21-hydroxylase deficiency，21-ohd，mim201910)是cah中最常见的类型，占95％；其次为11-β羟化酶缺乏症(11β-hydroxylase deficiency，11β-ohd，mim202010)，约占3％～5％；17α-羟化酶和17,20-裂解酶缺乏和3β-羟化酶缺陷，分别占1％左右；其它类型更少见。患儿如未能早期处理，易发生致命的肾上腺危象，早期干预除减少此风险外，还能最大限度地避免高雄激素血症导致儿童期线性生长的损害和远期生殖功能及激素代谢功能的影响。
3、多囊卵巢综合征(pcos)是一种常见的妇科内分泌疾病，起病多见于青春期，临床上多以月经不调为主要症状，可有不孕、多毛痤疮、肥胖、黑棘皮症等多种不同临床表现。在女性体内存在多种雄性激素，其中，睾酮(t)的血清水平高于其他雄性激素，是pcos中主要的病源性雄性激素。此外，硫酸脱氢表雄酮(dheas)、雄烯二酮(a4)、17-羟基孕酮(17-ohp)、双氢睾酮(dht)也是人体内重要的雄性激素类型，一些研究表明，这些激素的血清水平在pcos患者与正常人群中存在差别，可为pcos的诊断提供参考。17-ohp是类固醇合成通路中的中间物质，同时也是盐皮质激素和雄性激素的前体，许多相关专业学会推荐用于pcos病患诊断，以排除non-classiccah。
4、目前，对类固醇激素的检测，大多临床实验室主要采用荧光免疫分析法测定新生儿dbs样本中17-羟孕酮(17-ohp)水平作为新生儿cah一级筛查方法，该检测方法存在的交叉反应、基质干扰、灵敏度和特异度相对不高等情况都会导致假阳性率的偏高。而且一次试验只能测定一种激素，增加了所需采集的样本量和检测成本。类固醇激素在生物体内含量较低、结构相似、种类繁多，所以准确定量类固醇激素对仪器的灵敏度及方法的准确度有较高的要求。高效液相色谱-串联质谱技术(lc-ms/ms)具有可同时检测多目标物、线性范围宽、灵敏度和特异性高等优势，测定dbs中的类固醇激素谱，可有效降低筛查诊断中的假阳性。近几年，国内外一些实验室已将lc-ms/ms技术应用到类固醇激素谱的检验，但这些研究多是采集血清或血清作为检测样本，不利于标本的采集(尤其针对新生儿)、递送及保存。
技术实现思路
1、针对现有技术中类固醇激素检测中的问题，本发明的第一个目的是提供一种基于lc-ms/ms同时检测干血斑中多种类固醇激素的试剂盒，该试剂盒降低了采血需求，有利于标本的采集、递送及保存。
2、本发明的第二个目的是在于提供一种基于lc-msms同时检测干血斑中多种类固醇激素的应用，利用该试剂盒可采用lc-ms/ms同时检测干血斑中多种类固醇激素，实现了一份样本中的17种类固醇激素和17种d/13c/15n标记同位素激素同时分析检测的目的，具有高特异性和高准确性，可进一步应用于非医疗治疗目的对类固醇含量的检测。
3、为了实现上述目的，本发明提供了一种基于lc-msms同时检测干血斑中多种类固醇激素的试剂盒，包括校准品、质控品、洗脱液、同位素内标准品、萃取剂和复溶液；
4、所述校准品包括混合标准品和校正线替代基质；所述质控品包括混合标准品和人血液基质；人血液基质为充分清洗处理后的人全血。
5、所述校准品由七个浓度的混合标准品溶液由混标工作液添加到校正线替代基质中，稀释所制得；
6、所述校正线替代基质为空白血液基质；七个浓度的混合标准品溶液对应校正线高点d7点工作液的稀释倍数分别为1、2、5、10、25、50、100倍；
7、所述混合标准品包括孕酮、11-脱氧皮质酮、皮质酮、醛固酮、17-羟基孕烯醇酮、17α羟孕酮、21脱氧皮质醇、11脱氧皮质醇、皮质醇、可的松、脱氢表雄酮硫酸盐、雄烯二酮、睾酮、地塞米松、18-羟基皮质酮、18-羟基皮质醇和11β-酮睾酮。
8、本发明基于lc-ms/ms技术的试剂盒通过高效分离与高灵敏度检测的结合，实现了干血斑中17种类固醇激素及17种同位素标记激素的同时分析，其优势基于液相色谱提供精确的分离能力，而串联质谱确保了检测的高灵敏度和选择性，同位素内标提升了定量的准确性；干血斑样本的使用降低了采血量，便于储存与运输，校准品和质控品的加入保证了检测结果的标准化与质量控制，整体设计确保了全面、快速且可靠的多种类固醇激素检测，极大地提升了科研工作的效率与准确性。
9、同时，本发明技术方案的试剂盒中使用人血液基质与混合标准品混合作为质控品具有较低的基底值。
10、作为一种优选的方案，所述洗脱液由洗脱液a和洗脱液b组成；所述洗脱液a为含氟化铵甲醇水溶液；所述洗脱液b为纯甲醇溶液。
11、作为一种优选的方案，所述同位素内标准品包含黄体酮-d9、d7-11-脱氧皮质酮、皮质酮-d8、d7-醛固酮、[13c2；2h2]-17α-羟基孕烯醇酮、17α羟孕酮-d8、21-脱氧皮质醇-d8、11-脱氧皮质醇-d5、d4-皮质醇、可的松-d7、脱氢表雄酮硫酸钠盐-d6、雄烯二酮-d7、d4-睾酮、地塞米松-d4、18-羟基皮质酮-d4、18-羟基皮质醇-d4、11β-酮睾酮-d3。
12、作为一种优选的方案，所述萃取剂由氨水、乙腈和水组成。本发明的萃取剂可以有效实现干血斑中多种类固醇激素的提取，且发明人发现，萃取剂为纯有机相时，复溶后有多颗粒状不溶物，且会有干扰峰出现，而本发明中所选的萃取剂组合既可以保证多种类固醇激素的响应值，同时可以减小干扰峰的出现、保证目标物的出峰峰型。进一步优选乙腈和水的体积比为(70～80)％：(20～30)％，氨水的加入量为乙腈和水总体积的0.05～0.2％。
13、作为一种优选的方案，所述复溶液由氟化铵、甲醇和水组成。
14、本发明的校正线替代基质是根据cn116793787a所述方法合成的空白血液基质和由此滴制的干血片，可有效模拟人全血并具有超低基质效应。
15、作为一种优选的方案，所述校正线高点d7点中，孕酮、11-脱氧皮质酮、皮质酮、醛固酮、17-羟基孕烯醇酮、17α羟孕酮、21脱氧皮质醇、11脱氧皮质醇、皮质醇、可的松、脱氢表雄酮硫酸盐、雄烯二酮、睾酮、地塞米松、18-羟基皮质酮、18-羟基皮质醇、11β-酮睾酮的浓度分别为5000、500、5000、4000、25000、5000、4000、1000、100000、20000、1000000、4000、2500、5000、2000、1000、1600ng/dl。
16、作为一种优选的方案，所述同位素内标准品中，黄体酮-d9、d7-11-脱氧皮质酮、皮质酮-d8、d7-醛固酮、[13c2；2h2]-17α-羟基孕烯醇酮、17α羟孕酮-d8、21-脱氧皮质醇-d8、11-脱氧皮质醇-d5、d4-皮质醇、可的松-d7、脱氢表雄酮硫酸钠盐-d6、雄烯二酮-d7、d4-睾酮、地塞米松-d4、18-羟基皮质酮-d4、18-羟基皮质醇-d4、11β-酮睾酮-d3的目标浓度分别为500、50、500、400、2500、500、400、100、10000、2000、10000、400、250、5000、200、100、160ng/dl。
17、作为一种优选的方案，所述试剂盒中还包括色谱柱、96孔样本收集板和96孔封口板中的至少一种。
18、本发明的第二个目的是在于提供一种基于lc-ms/ms同时检测干血斑中多种类固醇激素的试剂盒的应用，向96孔样本收集板中加入包含类固醇激素的干血片样本和所述试剂盒中的同位素内标准品和萃取剂，硅胶盖密封孵育和萃取，移取上清液氮气吹干，加入所述试剂盒中的复溶液，孵育充分溶解，离心取上清液得待测样品，所述待测样品采用lc-ms/ms进行检测。
19、本发明对干血斑进行孵育是为了让干血斑里的待测物充分溶解到萃取液中。
20、作为一种优选的方案，lc-ms/ms的条件为：
21、色谱条件：
22、色谱柱：c18柱，50mm×2.1mm，1.7μm；柱温：40℃；洗脱液a：含氟化铵甲醇水溶液；洗脱液b：纯甲醇溶液，流速0.35ml/min，进样量，10μl；梯度洗脱：0～0.5min，0％b；0.5～0.6min，0～28.5％b；0.6～5.1min，28.5～30％b；5.1～5.2min，30～39％b；5.2～7.4min，39～40％b；7.4～7.5min，40～60％b；7.5～8.9min，60％b；8.9～9.5min，60～85％b；9.5～9.6min，85～100％b；9.6～10.2min，100％b；10.2～10.25min，100～0％b；10.25～11.5min，0％b；
23、质谱条件：在电喷雾正负离子切换模式下；采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压：1.5kv；去溶剂气温度：650℃；去溶剂气流速：800l/hr；同时监测目标物和同位素内标。
24、作为一种优选的方案，所述检测完成后使用所述试剂盒中的校准品溶液和同位素内标准品制作标准曲线，以校准品和同位素内标准品浓度为x轴，校准品和同位素内标准品峰面积为y轴；进行线性回归分析得回归方程，将相应待测物质峰面积代入回归方程，计算血斑样本中类固醇激素待测物质的浓度。
25、相对现有技术，本发明的有益效果包括但不限于：
26、(1)本发明提供的试剂盒应用时实现了一份样本中的17种类固醇激素和17种d/13c/15n标记同位素激素同时分析检测的目的，操作快速简便，不需要使用固相萃取及衍生化处理，检测种类多，通量高、特异性高、成本低，可有效监测干血斑中类固醇激素代谢通路的17个指标。
27、(2)本发明试剂盒的样本检测类型为干血斑，降低了采血需求，有利于标本的采集(尤其针对新生儿)、递送及保存。
28、(3)本发明试剂盒应用的检测方法具有高特异性和高准确性，首先是通过色谱条件优化，将同分异构体及其他干扰物进行了基线分离，有效避免了同分异构体及其他干扰物对指标测定结果的影响；其次，将处理后的分析物根据固有质/荷比进行直接检测，非传统对衍生物的间接检测，方法特异性强；最后，引入17种d/13c标记同位素作为内标定量，降低了不同基质间存在的基质效应对定量结果的影响。
29、(4)本发明试剂盒还提供了干血斑类固醇激素检测的校准品和质控品的制备方案。通过此种复配方式不仅可以有效降低基质效应，而且可以提高校准品和质控品的响应。
1.一种基于lc-ms/ms同时检测干血斑中多种类固醇激素的试剂盒，其特征在于：包括校准品、质控品、洗脱液、同位素内标准品、萃取剂和复溶液；
2.根据权利要求1所述的一种基于lc-ms/ms同时检测干血斑中多种类固醇激素的试剂盒，其特征在于：所述洗脱液由洗脱液a和洗脱液b组成；所述洗脱液a为含氟化铵甲醇水溶液；所述洗脱液b为纯甲醇溶液。
3.根据权利要求2所述的一种基于lc-ms/ms同时检测干血斑中多种类固醇激素的试剂盒，其特征在于：所述同位素内标准品包含黄体酮-d9、d7-11-脱氧皮质酮、皮质酮-d8、d7-醛固酮、[13c2；2h2]-17α-羟基孕烯醇酮、17α羟孕酮-d8、21-脱氧皮质醇-d8、11-脱氧皮质醇-d5、d4-皮质醇、可的松-d7、脱氢表雄酮硫酸钠盐-d6、雄烯二酮-d7、d4-睾酮、地塞米松-d4、18-羟基皮质酮-d4、18-羟基皮质醇-d4和11β-酮睾酮-d3。
4.根据权利要求1～3任一项所述的一种基于lc-ms/ms同时检测干血斑中多种类固醇激素的试剂盒，其特征在于：
5.根据权利要求1所述的一种基于lc-ms/ms同时检测干血斑中多种类固醇激素的试剂盒，其特征在于：所述校正线高点d7点中，孕酮、11-脱氧皮质酮、皮质酮、醛固酮、17-羟基孕烯醇酮、17α羟孕酮、21脱氧皮质醇、11脱氧皮质醇、皮质醇、可的松、脱氢表雄酮硫酸盐、雄烯二酮、睾酮、地塞米松、18-羟基皮质酮、18-羟基皮质醇、11β-酮睾酮的浓度分别为5000、500、5000、4000、25000、5000、4000、1000、100000、20000、1000000、4000、2500、5000、2000、1000、1600ng/dl。
6.根据权利要求3所述的一种基于lc-ms/ms同时检测干血斑中多种类固醇激素的试剂盒，其特征在于：所述同位素内标准品中，黄体酮-d9、d7-11-脱氧皮质酮、皮质酮-d8、d7-醛固酮、[13c2；2h2]-17α-羟基孕烯醇酮、17α羟孕酮-d8、21-脱氧皮质醇-d8、11-脱氧皮质醇-d5、d4-皮质醇、可的松-d7、脱氢表雄酮硫酸钠盐-d6、雄烯二酮-d7、d4-睾酮、地塞米松-d4、18-羟基皮质酮-d4、18-羟基皮质醇-d4、11β-酮睾酮-d3的目标浓度分别为500、50、500、400、2500、500、400、100、10000、2000、10000、400、250、5000、200、100、160ng/dl。
7.根据权利要求5或6所述的一种基于lc-ms/ms同时检测干血斑中多种类固醇激素的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括色谱柱、96孔样本收集板和96孔封口板中的至少一种。
8.权利要求1～7任一项所述的一种基于lc-ms/ms同时检测干血斑中多种类固醇激素的试剂盒的应用，其特征在于：向96孔样本收集板中加入包含类固醇激素的干血片样本和所述试剂盒中的同位素内标准品和萃取剂，硅胶盖密封孵育和萃取，移取上清液氮气吹干，加入所述试剂盒中的复溶液，孵育充分溶解，离心取上清液得待测样品，所述待测样品采用lc-ms/ms进行检测。
9.根据权利要求8所述的一种基于lc-ms/ms同时检测干血斑中多种类固醇激素的试剂盒的应用，其特征在于：lc-ms/ms的条件为：
10.根据权利要求9所述的一种基于lc-ms/ms同时检测干血斑中多种类固醇激素的试剂盒的应用，其特征在于：所述检测是使用所述试剂盒中的校准品溶液和同位素内标准品制作标准曲线对前处理后的样品进行量化，其中，以校准品和同位素内标准品浓度为x轴，校准品和同位素内标准品峰面积为y轴；进行线性回归分析得回归方程，将相应待测物质峰面积代入回归方程，计算血斑样本中类固醇激素待测物质的浓度。
