本发明涉及生物医用材料，尤其涉及一种用于创面愈合的抗氧化凝胶及其制备方法和应用。
背景技术：
1、氧化应激(oxidative stress，os)是指体内氧化剂生成和抗氧化防御之间的不平衡，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物，对生物系统造成损害。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。
2、创面的快速愈合，特别是难愈性创面的愈合促进是非常重要的，能够显著减少并发症以及改善病人的生活质量，而难愈性创面的成因当中，过度的氧化应激扮演着重要的角色。过度的氧化应激会延缓愈合过程，对细胞的生长、增殖及修复功能产生不利影响，从而延缓难愈性创面的愈合过程。同时，氧化应激会损伤细胞结构，导致细胞膜的脂质过氧化，损伤细胞膜结构，使细胞易受到外界环境的侵害，进而影响创面的修复。氧化应激也会加剧炎症反应，影响炎症细胞的调节和修复功能，进一步阻碍难愈性创面的愈合。所以，有效抑制氧化应激能够提升创面愈合的效率。目前，透明质酸凝胶是一种良好的创面敷料，已经在临床上得到大量的应用。然而传统的透明质酸敷料组织粘附能力不强，同时抗氧化能力不足，限制了其有效性。
3、因此，如何实现透明质酸的组织粘附能力，从而进一步提升抗氧化作用已成为目前亟待解决的问题。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本发明提供一种用于创面愈合的抗氧化凝胶及其制备方法和应用，本发明通过半胱氨酸改性的透明质酸与聚乙二醇羧基活化酯交联形成水凝胶网络，显著提升了透明质酸凝胶的组织粘附能力，并进一步提升了抗氧化能力和抗炎能力，上述水凝胶材料组分简单且生物相容性好，交联网络稳定且生物安全。
2、为达此目的，本发明采用以下技术方案：
3、第一方面，本发明提供了一种用于创面愈合的抗氧化凝胶，所述抗氧化凝胶以质量份数计包括0.01-20份透明质酸、0.01-20份半胱氨酸、1-50份聚乙二醇羧基活化酯。
4、所述0.01-20份，例如可以是0.01份、1份、2份、3份、4份、5份、6份、7份、8份、9份、10份、11份、12份、13份、14份、15份、16份、17份、18份、19份或20份等。
5、所述1-50份，例如可以是1份、2份、3份、4份、5份、6份、7份、8份、9份、10份、11份、12份、13份、14份、15份、16份、17份、18份、19份、20份、21份、22份、23份、24份、25份、26份、27份、28份、29份、30份、31份、32份、33份、34份、35份、36份、37份、38份、39份、40份、41份、42份、43份、44份、45份、46份、47份、48份、49份或50份等。
6、本发明中，利用半胱氨酸修饰透明质酸，制备半胱氨酸修饰的透明质酸。同时采用聚乙二醇羧基活化酯与修饰的透明质酸通过羧基活化酯与硫醇基的硫酯化反应进行微交联。提升透明质酸的留存能力。一方面通过半胱氨酸未反应的巯基与组织表面发生化学键合，增强水凝胶粘附性，同时未交联聚乙二醇羧基活化酯位点和组织表面蛋白质发生交联，从而将抗氧化凝胶固定在组织上，进一步提升水凝胶的组织粘附性。另一方面，利用半胱氨酸中的巯基的抗氧化效应，减缓创面的氧化应激，从而加速难愈性创面的愈合。相比于传统的氧化应激控制方案，例如纳米酶、药物等，该方案简单而且生物相容性更好。利用聚乙二醇羧基活化酯和透明质酸的交联，形成凝胶，提升整体的稳定性。
7、优选地，所述聚乙二醇羧基活化酯可为式i、式ii、式iii和式iv中任一种：
8、
9、其中，各式中，z为20～300之间的自然数，可为29～228、29、34、38、45、57、136、181或228；
10、基团r为式a或式b，式a和式b中，m表示氮原子、氧原子、硫原子、磷原子，优选氧原子、氮原子或硫原子，连接于聚乙二醇端，x或y为1～5之间的整数，如0、2或3；基团r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9、r10、r11、r12、r13、r14、r15和r16均独立地为氢原子、羟基、碳原子数为1～10的烷基、苯基或磺酸基。
11、优选地，所述聚乙二醇羧基活化酯具体可为如下1)-8)中任一种：
12、1)如式i所示，其中，r为式a，式a中，x为2～3，m为氧原子，z为136，r1、r2、r3和r4均为氢原子；
13、2)如式i所示，其中，r为式b，式b中，y为1～2，m为氧原子，z为228，r1、r2、r3和r4均为氢原子；
14、3)如式ii所示，其中，r为式a，式a中，x为2～3，m为氧原子，z为57，r1、r2、r3和r4均为氢原子，r5、r6、r7和r8均为羟基；
15、4)如式ii所示，其中，r为式b，式b中，y为1～2，m为氧原子，z为57，r1、r2、r3和r4均为氢原子，r5、r6、r7和r8均为羟基；
16、5)如式iii所示，其中，r为式a，式a中，x为2～3，m为氮原子，z为38，r1、r2、r3和r4均为氢原子，r5、r6、r7和r8均为甲基，r9、r10、r11和r12为苯基；
17、6)如式iii所示，其中，r为式b，式b中，y为1～2，m为硫原子，z为29，r1、r2、r3和r4均为氢原子，r5、r6、r7和r8均为磺酸基，r9、r10、r11和r12为苯基；
18、7)如式ⅳ所示，其中，r为式a，式a中，x为3～5，m为氮原子，z为29，r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7和r8均为磺酸基，r9、r10、r11、r12、r13、r14、r15和r16为氢原子；
19、8)如式ⅳ所示，其中，r为式b，式b中，y为2～4，m为氮原子，z为29，r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7和r8均为磺酸基，r9、r10、r11、r12、r13、r14、r15和r16为氢原子。
20、优选地，所述聚乙二醇骨架的分子量为2000-10000。，例如可以是2000、4000、6000、8000或10000等。
21、优选地，所述透明质酸的分子量为(20-150)×104，所述(20-150)例如可以是20-40、40-80、80-150等。
22、优选地，所述半胱氨酸和透明质酸的质量比为1:(0.01-3)。所述(0.01-3)，例如可以是0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5或3等。
23、本发明中，在上述范围内，半胱氨酸的投料比过低，透明质酸接枝率低，功能提升不明显；半胱氨酸完全改性透明质酸羧基，最大程度提升透明质酸接枝率，进一步提升水凝胶的组织粘附性和抗氧化能力。
24、第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的用于创面愈合的抗氧化凝胶的制备方法，所述制备方法包括：
25、将透明质酸加入溶液中，第一次搅拌直至完全溶解，溶解后加入催化剂继续第二次搅拌活化透明质酸羧基，随后加入半胱氨酸进行反应，反应完成后反应液经过透析、冻干获得半胱氨酸修饰的透明质酸冻干粉，将修饰的透明质酸冻干粉和聚乙二醇羧基活化酯分别溶解后混合均匀获得抗氧化凝胶。
26、优选地，所述透明质酸溶液的溶剂包括无菌水和/或缓冲液。
27、优选地，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲生理盐水、tris-盐酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液或碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中的任意一种或至少两种组合。
28、优选地，所述透明质酸溶液的ph为4-7，例如可以是4、4.5、5、5.5、6、6.5或7等。
29、优选地，所述催化剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和保护剂的组合。
30、优选地，所述保护剂包括n-羟基丁二琥珀酰亚胺和/或n-羟基磺基琥珀酰亚胺。
31、优选地，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以质量分数计加入0.005-30份，例如可以是0.005份、0.05份、0.5份、1份、5份、10份、15份、20份、25份或30份等。
32、优选地，所述保护剂以质量分数计加入0.006-34份，例如可以是0.006份、0.05份、0.5份、1份、5份、10份、15份、20份、25份、30份或34份等。
33、优选地，所述催化剂中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和保护剂的摩尔比为(1-3):(2-5)。所述(1-3)，例如可以是1、2或3等。所述(2-5)，例如可以是2、3、4或5等。
34、优选地，所述第一次的速度为200-1000rpm，时间为40min-12h，所述40min-12h，例如可以是40min、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h或12h等。所述200-1000rpm，例如可以是200rpm、400rpm、600rpm、800rpm或1000rpm。
35、优选地，所述第二次搅拌的速度为200-1000rpm，时间为20-40min，所述20-40min，例如可以是20min、22min、24min、26min、28min、30min、32min、34min、36min、38min或40min等。所述200-1000rpm，例如可以是200rpm、400rpm、600rpm、800rpm或1000rpm。
36、优选地，所述反应的气体环境包括空气、氮气、氩气或氦气中的任意一种或至少两种的组合。
37、优选地，所述反应的时间为4-12h，例如可以是4h、6h、8h、10h或12h等。
38、优选地，所述透析的溶液包括超纯水、去离子水、纯化水或透析缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。
39、优选地，所述透析缓冲液包括磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲生理盐水、tris-盐酸缓冲液、hepes两性离子缓冲液或氨基酸缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。
40、优选地，所述透析的溶液的ph为4-7，例如可以是4、4.5、5、5.5、6、6.5或7等。
41、优选地，所述透析的透析袋截留分子量为1000-25000，例如可以是1000、2000、3500、5000、7000、8000、10000、15000、25000。
42、优选地，所述透析的时间为2-5天，例如可以是2天、3天、4天或5天等。
43、优选地，所述冻干的方法包括将纯化的反应液分装后置于低温下冷冻处理，冻结后使用冷冻干燥机将反应物中的溶剂升华干燥，得到干燥产物。
44、所述溶解透明质酸冻干粉的溶剂包括无菌水和/或缓冲液1。
45、优选地，所述缓冲液1包括磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲生理盐水、tris-盐酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液或碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中的任意一种或至少两种组合。
46、优选地，所述溶解聚乙二醇羧基活化酯的溶剂包括无菌水和/或缓冲液2。
47、优选地，所述缓冲液2包括磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲生理盐水、tris-盐酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液或碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中的任意一种或至少两种组合。
48、优选的，所述聚乙二醇羧基活化酯的质量浓度为1-50％，例如可以是1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％等。
49、优选地，所述修饰的透明质酸冻干粉的质量浓度为0.01-20％，例如可以是0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％等。
50、优选地，所述混合中聚乙二醇羧基活化酯溶液和修饰的透明质酸溶液的体积比为1:(0.1-5)，所述(0.1-5)，例如可以是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4或5等。
51、第三方面，本发明提供一种第一方面所述的用于创面愈合的抗氧化凝胶在以非治疗目的的减缓氧化应激或制备减缓氧化应激的产品中的应用。
52、所述产品可包括用于创面愈合的药物等。
53、与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
54、1.本发明采用半胱氨酸修饰透明质酸，半胱氨酸改性的透明质酸与聚乙二醇羧基活化酯交联形成水凝胶网络，通过半胱氨酸未反应的巯基与组织表面发生化学键合，同时未交联聚乙二醇羧基活化酯位点和组织表面蛋白质发生交联，从而将抗氧化凝胶固定在组织上，提升水凝胶的组织粘附性。
55、2.本发明的巯基的抗氧化效应，减缓创面的氧化应激，从而加速难愈性创面的愈合。相比于传统的氧化应激控制方案，例如纳米酶、药物等，该方案简单而且生物相容性更好。利用聚乙二醇羧基活化酯和透明质酸的交联，形成凝胶，提升整体的稳定性。
1.一种用于创面愈合的抗氧化凝胶，其特征在于，所述抗氧化凝胶以质量份数计包括0.01-20份透明质酸、0.01-20份半胱氨酸和1-50份聚乙二醇羧基活化酯。
2.根据权利要求1所述的抗氧化凝胶，其特征在于，所述聚乙二醇羧基活化酯可为式i、式ii、式iii和式iv中任一种：
3.根据权利要求1或2所述的抗氧化凝胶，其特征在于，所述半胱氨酸和透明质酸的质量比为1：(0.01-3)。
4.一种如权利要求1-3中任一项所述的用于创面愈合的抗氧化凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述透明质酸溶液的溶剂包括无菌水和/或缓冲液；
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述透析的溶液包括超纯水、去离子水、纯化水或透析缓冲液中的任意一种或至少两种的组合；
7.根据权利要求4-6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述冻干的方法包括将纯化的反应液分装后置于低温下冷冻处理，冻结后使用冷冻干燥机将反应物中的溶剂升华干燥，得到干燥产物。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述溶解透明质酸冻干粉的溶剂包括无菌水和/或缓冲液1；
9.根据权利要求4-8中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇羧基活化酯的质量浓度为1-50％；
10.一种根据权利要求1-3中任一项所述的用于创面愈合的抗氧化凝胶在以非治疗目的的抑制氧化应激或制备抑制氧化应激的产品中的应用。
