(一)本发明涉及一种降低5-氯烟腈选择性提高6-氯烟腈选择性的腈水解酶突变体及其应用，特别涉及一种来源于伯克霍尔德氏杆菌(paraburkholderia graminis)的腈水解酶突变体及在选择性催化6-氯烟腈合成6-氯烟酸中的应用。
背景技术：
0、(二)背景技术
1、氯代烟酸类化合物是农药和医药化学品合成的重要中间体，根据氯原子取代位置的不同可以分为2-氯烟酸、4-氯烟酸、5-氯烟酸、6-氯烟酸。如2-氯烟酸是一类氮杂环类化合物，在医药方面可用于合成抗艾滋病药奈韦拉平、消炎药普拉洛芬，在农药方面可以合成除草剂烟嘧磺隆、吡氟酰草胺，杀菌剂啶酰菌胺等。6-氯烟酸广泛应用于治疗银屑病、痤疮的第三代芳香维a酸类药物他扎罗汀中间体以及其他医药中间体、新兴农药产品的合成领域，因此，氯代烟酸有着十分广阔的工业应用前景。
2、传统氯代烟酸化学合成工艺以3-氰基吡啶为原料，经氧化、氯化制备氯代烟腈混合物后再进行高温碱性水解获得。而由于化学水解缺乏选择性，需经多次重结晶分离得到高纯度单一产物。因化学合成法工序多、收率低、废盐量大，高纯度氯代烟酸的酶法合成技术受到广泛关注。
3、腈水解酶(nitrilase,ec 3.5.5.1)是一类能够催化腈类化合物水解生成羧酸和氨的酶，其介导的生物催化过程具有反应条件温和、催化效率高、环境友好等特点，在高附加值羧酸等化学品的制备中具有重要应用。以腈水解酶为催化剂，可选择性催化氯代烟腈合成相应的氯代烟酸，从而重构氯代烟酸的一步酶法合成路线，原子经济性显著提高，大幅减少碱的用量，降低三废排放。但是不同结构的腈水解酶对氯代烟腈的选择性不同，比如在前期的研究中，我们筛选获得了paraburkholderia graminis来源的腈水解酶，通过分子改造，获得了突变体pgnit-a55s，对6-氯烟腈有较好的催化性能，并消除了对2-氯烟腈的水合活力，过程中无2-氯烟酰胺产生(cn202211100878.3)，解决了6-氯烟腈与2-氯烟腈为共同底物时显著提高了6-氯烟腈的选择性。但是，在我们进一步的研究中发现，该酶同时对5-氯烟腈有活力，在以6-氯烟腈和5-氯烟腈混合物为底物的时候，分别具有90％以上的转化率。而传统的以3-氰基吡啶为原料，经氧化、氯化制备的通常是氯代烟腈混合物，即底物中除了6-氯烟腈外，还有2-氯烟腈和5-氯烟腈存在，由此底物选择性不高的腈水解酶催化后带来单一产品分离纯化困难的问题。因此，进一步调控该酶的底物选择性，消除其对5-氯烟腈的催化活性具有重要意义。
技术实现思路
0、(三)
技术实现要素：
1、本发明目的是提供一种降低5-氯烟腈选择性提高6-氯烟腈选择性的腈水解酶突变体及其应用，将来源于伯克霍尔德氏杆菌(paraburkholderia graminis)的腈水解酶pgnit进行了改造，提高对6-氯烟腈的选择性且降低对5-氯烟腈的选择性，特别获得了突变体pgnit-r128a/d144k/s146r(pgnit-m3)，催化水解100g/l的5-氯烟腈和6-氯烟腈的转化率分别为2.8％和99.8％，显著降低了对5-氯烟腈的催化效率，提升了酶的底物选择性，解决了传统腈水解酶催化氯代底物反应选择性差的问题。
2、本发明采用的技术方案是：
3、本发明提供一种降低5-氯烟腈选择性提高6-氯烟腈选择性的腈水解酶突变体，所述腈水解酶突变体是将seq id no.2所示氨基酸序列第128位、第144位、第146位进行单突变或多突变获得的。
4、进一步，所述腈水解酶突变体是将seq id no.2所示氨基酸突变为下列之一：(1)第128位的精氨酸突变为丙氨酸(pgnit-r128a)，核苷酸序列如seq id no.3所示，氨基酸序列如seq id no.4所示；(2)第128位的精氨酸突变为丙氨酸、第144位的天冬氨酸突变为赖氨酸(pgnit-r128a/d144k)，核苷酸序列如seq id no.5所示，氨基酸序列如seq id no.6所示；(3)第128位的精氨酸突变为丙氨酸、第144位的天冬氨酸突变为赖氨酸、第146位的丝氨酸变成精氨酸(pgnit-r128a/d144k/s146r)，核苷酸序列如seq id no.7所示，氨基酸序列如seq id no.8所示。
5、本发明还提供一种所述腈水解酶突变体的编码基因构建的重组载体，以及重组基因工程菌。
6、所述重组载体的基础载体没有限制，只要其可以在原核和/或真核细胞的各种宿主细胞中保持编码基因复制或自主复制即可，所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，优选pet-28b(+)。所述重组基因工程菌的宿主细胞没有限制，只要已经为其建立了重组表达系统，满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本发明的腈水解酶基因可以有效表达。例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、放线菌、曲霉菌，以及动物细胞和高等植物细胞。本发明优选大肠杆菌，更优选e.coli bl21(de3)。
7、本发明选择pet28b(+)作为表达载体用于腈水解酶及其突变体的表达，具体地，将目的基因插入在质粒pet28b(+)上的ncoi和xhoi之间，转化于e.coli bl21(de3)宿主细胞中。
8、本发明提供一种腈水解酶突变体在选择性催化6-氯烟腈合成6-氯烟酸中的应用，所述的应用为：以含腈水解酶突变体编码基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体提取的粗酶液为催化剂，以6-氯烟腈和5-氯烟腈为底物，以ph 6.0-9.0的缓冲液为反应介质，在25-40℃条件下进行反应，获得5-氯烟酸含量明显降低且富含6-氯烟酸的反应液。所述粗酶液加入量以破碎前湿菌体重量计，所述湿菌体加入量以缓冲液体积计为2-20g/l，优选10g/l；所述6-氯烟腈和5-氯烟腈加入量以缓冲液体积计各自独立为100-500g/l，各自均优选为100g/l。所述缓冲液优选50mm、ph 7.0的pb缓冲液。优选所述反应温度为30℃。
9、所述催化剂按如下方法制备：
10、1)平板培养：将含腈水解酶突变体编码基因的重组大肠杆菌经平板划线接种至含50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基，经37℃过夜活化，获得单菌落；所述lb固体培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，琼脂15g/l，溶剂为水，ph 7.0；
11、2)种子培养：将单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，于37℃，180rpm培养10-12h，获得种子液；所述lb液体培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，溶剂为水，ph 7.0；
12、3)发酵培养：将种子液以体积浓度2％的量接种至含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基，于37℃，180rpm条件下培养至od600为0.6-0.8，加入终浓度为0.1mm的异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)，于28℃，180rpm条件下诱导培养10-12h，菌液在8000rpm，4℃下离心，收集湿菌体；
13、4)湿菌体破碎：将湿菌体悬浮于ph 5.0～9.0的缓冲液，置于超声破碎仪中，10-50khz频率下(优选20khz)破碎5-30min(优选破碎2min，间隔10s，破碎10min)，收集破碎混合液，即获得粗酶液；所述ph 5.0～9.0的缓冲液体积用量以湿菌体湿重计为10ml/g。
14、与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
15、本发明筛选获得对5-氯烟腈选择性降低且6-氯烟腈选择性明显提高的腈水解酶突变体，以含腈水解酶突变体基因的重组细胞或其破碎粗酶液为催化剂，以6-氯烟腈和5-氯烟腈为共同底物，能够选择性催化6-氯烟腈，一步合成高纯度6-氯烟酸，过程简单，工业成本较低。与野生型相比，突变体降低了对5-氯烟腈的催化活力，提高了对6-氯烟腈的选择性，有利于提高底物专一性。在湿菌体用量10g/l体系下，野生型腈水解酶pgnit催化100g/l6-氯烟腈和100g/l 5-氯烟腈合成6-氯烟酸和5-氯烟酸，转化率均>90％；而腈水解酶突变体pgnit-r128a/d144k/s146r催化100g/l 6-氯烟腈和100g/l 5-氯烟腈合，6-氯烟酸转化率达99.8％以上，5-氯烟酸转化率降低为2.8％。
1.一种降低5-氯烟腈选择性提高6-氯烟腈选择性的腈水解酶突变体，其特征在于，所述腈水解酶突变体是将seq id no.2所示氨基酸序列第128位、第144位、第146位进行单突变或多突变获得的。
2.如权利要求1所述的腈水解酶突变体，其特征在于，所述腈水解酶突变体是将se qid no.2所示氨基酸突变为下列之一：(1)第128位的精氨酸突变为丙氨酸；(2)第128位的精氨酸突变为丙氨酸、第144位的天冬氨酸突变为赖氨酸；(3)第128位的精氨酸突变为丙氨酸、第144位的天冬氨酸突变为赖氨酸、第146位的丝氨酸变成精氨酸。
3.一种权利要求1所述腈水解酶突变体的编码基因构建的重组基因工程菌。
4.一种权利要求1腈水解酶突变体在选择性催化6-氯烟腈合成6-氯烟酸中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用为：以含腈水解酶突变体编码基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体提取的粗酶液为催化剂，以6-氯烟腈和5-氯烟腈为底物，以ph 6.0-9.0的缓冲液为反应介质，在25-40℃条件下进行反应，获得5-氯烟酸含量明显降低且富含6-氯烟酸的反应液。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述粗酶液加入量以破碎前湿菌体重量计，所述湿菌体加入量以缓冲液体积计为2-20g/l；所述6-氯烟腈和5-氯烟腈加入量以缓冲液体积计各自独立为100-500g/l。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述缓冲液为50mm、ph 7.0的pb缓冲液；所述反应温度为30℃。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述催化剂按如下方法制备：
