本发明属于类固醇激素检测，具体涉及一种液相色谱质谱联用技术测定体液中多种类固醇激素的方法及试剂盒。
背景技术：
1、类固醇激素是一类具有环戊烷多氢菲结构的小分子甾体激素，按照生理功能可分为孕激素、盐皮质激素、糖皮质激素、雌激素和雄激素。类固醇激素对人体新陈代谢、生长、发育及生殖行为、维持内环境稳定等方面起着重要的调节作用。临床上将类固醇激素水平作为较多疾病的诊断指标，包括先天性类固醇代谢紊乱(如先天性肾上腺增生、先天性发育障碍和先天性盐稳态失调等)和获得性类固醇代谢紊乱(如原发性醛固酮增多症、多囊卵巢综合征、库欣综合征、艾迪生病、高雄激素血症及精神状态疾病)等。除此之外，还有一些外源性的类固醇激素，如地塞米松、泼尼松龙等，主要是人工合成的用于治疗相关疾病的类固醇激素药物。
2、类固醇激素在生物体内含量较低、结构相似、种类繁多，所以准确定量类固醇激素对仪器的灵敏度及方法的准确度有较高的要求。目前类固醇激素的临床检测方法主要有化学免疫法、lc-ms/ms、气相色谱-质谱联用技术。化学免疫法因操作简单快速，在临床广泛应用。但传统的化学免疫法存在很多缺陷，已逐渐被色谱法替代。气相色谱-质谱联用技术灵敏度高，但往往需要烦琐的衍生化步骤和较长的分析时间(一般≥30min)，且目前缺乏一种适用于所有类固醇激素的衍生化试剂。lc-ms/ms技术则避免了气相色谱法烦琐的衍生化步骤，且专属性强，能够很好地排除基质中类似结构物质的干扰，是目前最可靠的检测方法。lc-ms/ms检测方法中，也有通过化学衍生或者固相萃取的前处理方法，但是会增加操作的复杂度和较高的成本。
3、此外，目前使用lc-ms/ms技术开展类固醇激素的检测基本上所覆盖类固醇激素代谢通路的指标都不够全面，不能更好的帮助研究者准确检测每种类固醇激素的浓度并了解其相互之间的代谢通路。
技术实现思路
1、针对现有技术中类固醇激素检测中的问题，本发明的第一个目的是在于提供了一种液相色谱质谱联用技术测定体液中多种类固醇激素的方法，该方法操作快速简便，检测种类多，通量高、特异性高、成本低，可有效且系统的监测类固醇激素全通路代谢的28个指标。
2、本发明的第二个目的是在于提供一种液相色谱质谱联用技术测定体液中多种类固醇激素的试剂盒，该试剂盒不仅提升了检测的效率和精度，也降低了检测成本，简化了操作流程，为内分泌疾病的科学研究提供了有力的工具。
3、为了实现上述技术目的，本发明提供了一种液相色谱质谱联用技术测定体液中多种类固醇激素的方法，该方法是向96孔板中加入包含类固醇激素的体液样品、同位素内标、盐析辅助试剂和萃取剂混合后进行萃取，萃取液经过浓缩，得待测样品；所述待测样品采用uplc-ms/ms进行检测；
4、所述盐析辅助试剂为饱和碳酸氢钠和碳酸铵溶液中的至少一种；
5、所述萃取剂为甲基叔丁基醚、正己烷、乙酸乙酯和三氯甲烷中的至少一种。进一步优选萃取剂由甲基叔丁基醚、乙酸乙酯和正己烷按照体积比为(1～3)：(1～2)：1。
6、本发明的技术方案无需进行固相萃取及衍生化处理关键在于利用前处理过程中盐析辅助试剂和萃取剂相互配合使用，其中盐析辅助试剂可通过增加盐的浓度来改变样品溶液的离子强度，从而促进目标分析物从水相向有机相的转移，因而增加目标分析物在有机相中的分配系数，再通过液液萃取可以进一步净化提取液，除去未被盐析效应影响的其他组分，提高最终分析物的纯度。通过本发明的前处理过程可以有效提取28种类固醇激素和24种同位素标记内标，再结合uplc-ms/ms检测可以实现体液中28种类固醇激素的快速且精确的检测。
7、发明人发现，本发明加入盐析辅助试剂，在本发明的色谱条件下还可以辅助提高雌激素的响应值并改善杂峰的出峰，进一步优选盐析辅助试剂的用量为10～50μl的100mg/ml nahco3。
8、作为一种优选的方案，所述体液样品包括血清、血浆、尿液、羊水和脑脊液。
9、作为一种优选的方案，所述类固醇激素包括孕烯醇酮、孕酮、11-脱氧皮质酮、皮质酮、醛固酮、17-羟基孕烯醇酮、17α羟孕酮、21脱氧皮质醇、11脱氧皮质醇、皮质醇、可的松、脱氢表雄酮、脱氢表雄酮硫酸盐、雄烯二酮、睾酮、双氢睾酮、雌酮、雌二醇、雌三醇、地塞米松、18-羟基皮质酮、18-氧皮质醇、18-羟基皮质醇、11β-羟睾酮、11β-酮睾酮、雄酮、泼尼松龙和表睾酮中的至少两种。
10、作为一种优选的方案，所述同位素内标包括d4-孕烯醇酮、黄体酮-d9、d7-11-脱氧皮质酮、皮质酮-d8、d7-醛固酮、[13c2；2h2]-17α-羟基孕烯醇酮、17α羟孕酮-d8、21-脱氧皮质醇-d8、11-脱氧皮质醇-[d5]、d4-皮质醇、可的松-[d7]、脱氢表雄酮-[d6]、脱氢表雄酮-[d6]硫酸钠盐、雄烯二酮-d7、d4-睾酮、双氢睾酮-d4、d4-雌酮、雌二醇-d4、雌三醇-d3、地塞米松-d4、18-羟基皮质酮-d4、18-羟基皮质醇-d4、11β-酮睾酮-d3和雄甾酮-[d4]中至少两种。
11、作为一种优选的方案，所述uplc-ms/ms的条件为：
12、色谱条件：
13、色谱柱：c18柱，50mm×2.1mm，1.7μm；柱温：40℃；洗脱液a：含氟化铵甲醇水溶液；洗脱液b：纯甲醇溶液，流速0.35ml/min，进样量，10μl；梯度洗脱：0～0.5min，0％b；0.5～0.6min，0～28.5％b；0.6～5.1min，28.5～30％b；5.1～5.2min，30～39％b；5.2～7.4min，39～40％b；7.4～7.5min，40～60％b；7.5～8.9min，60％b；8.9～9.5min，60～85％b；9.5～9.6min，85～100％b；9.6～10.2min，100％b；10.2～10.25min，100～0％b；10.25～11.5min，0％b；
14、质谱条件：在电喷雾(esi)正负离子切换模式下；采用多反应监测(mrm)的质谱扫描模式，毛细管电压(capillary)：1.5kv；去溶剂气温度：650℃；去溶剂气流速：800l/hr；同时监测目标物和同位素内标。
15、作为一种优选的方案，所述浓缩为经离心采用自动化平台移取上清液，氮吹、复溶，震荡离心。
16、作为一种优选的方案，所述自动化平台使用遗传代谢样本前处理系统、空气置换式的移液模式，4通道自动化移液设备将上清液从萃取板转移到上机板中。进一步优选，自动化平台为博圣智造的遗传代谢样本(液相色谱-串联质谱法)前处理系统(浙杭械备20200789号)，所述自动化转板程序描述：开始移液→移液通道从枪头位取枪头→移液通道在萃取位吸液→移液通道在上机位吐液→移液通道在废物槽去枪头→整板移液结束。
17、作为一种优选的方案，所述复溶采用洗脱液a和/或洗脱液b作为复溶液。
18、本发明的第二个目的是在于提供一种液相色谱质谱联用技术测定体液中多种类固醇激素的试剂盒，包括洗脱液、同位素内标液、盐析辅助试剂、萃取剂、校准品稀释液、质控品、复溶液和色谱柱；所述洗脱液包括洗脱液a和洗脱液b，其中，洗脱液a为氟化铵甲醇水溶液，洗脱液b为纯甲醇溶液。
19、作为一种优选的方案，洗脱液a的浓度为0.05～0.5mmol/l的氟化铵甲醇水溶液。
20、作为一种优选的方案，所述校准品稀释液由七个浓度的混合标准品溶液由校正线基质添加到混标工作液中稀释制得。
21、作为一种优选的方案，所述校正线基质为由牛血清蛋白和磷酸缓冲盐溶液组成的替代基质。
22、作为一种优选的方案，所述质控品含有三个水平的低、中、高浓度质控血清，质控品由活性炭净化的血清空白样本或无激素血清或无激素血浆添加混合激素标准物质制得，并通过检测确定靶值。
23、作为一种优选的方案，所述七个浓度的混合标准品溶液对应混标s7工作液的稀释倍数分别为1、2、5、10、25、50、100倍。
24、作为一种优选的方案，所述混标工作液中，孕烯醇酮、孕酮、11-脱氧皮质酮、皮质酮、醛固酮、17-羟基孕烯醇酮、17α羟孕酮、21脱氧皮质醇、11脱氧皮质醇、皮质醇、可的松、脱氢表雄酮、脱氢表雄酮硫酸盐、雄烯二酮、睾酮、双氢睾酮、雌酮、雌二醇、雌三醇、地塞米松、18-羟基皮质酮、18-氧皮质醇、18-羟基皮质醇、11β-羟睾酮、11β-酮睾酮、雄酮、泼尼松龙、表睾酮的浓度分别为20000、5000、250、5000、500、10000、5000、200、1000、100000、20000、7500、2000000、2000、2500、1250、500、1000、200、5000、1000、200、1000、200、800、4000、2500、500ng/dl。
25、作为一种优选的方案，所述同位素内标液中，d4-孕烯醇酮、黄体酮-d9、d7-11-脱氧皮质酮、皮质酮-d8、d7-醛固酮、[13c2；2h2]-17α-羟基孕烯醇酮、17α羟孕酮-d8、21-脱氧皮质醇-d8、11-脱氧皮质醇-[d5]、d4-皮质醇、可的松-[d7]、脱氢表雄酮-[d6]、脱氢表雄酮-[d6]硫酸钠盐、雄烯二酮-d7、d4-睾酮、双氢睾酮-d4、d4-雌酮、雌二醇-d4、雌三醇-d3、地塞米松-d4、18-羟基皮质酮-d4、18-羟基皮质醇-d4、11β-酮睾酮-d3和雄甾酮-[d4]的浓度分别为4000、2000、100、2000、200、4000、2000、80、400、40000、8000、3000、800000、800、1000、500、200、400、80、2000、400、400、320、1600ng/dl。
26、相对现有技术，本发明的有益效果包括但不限于：
27、(1)本发明提供的液相色谱质谱联用技术测定体液中28种类固醇激素的方法，前处理快速简便，无需使用复杂的固相萃取及衍生化处理，仅通过盐析辅助液液萃取过程就能有效提取28种类固醇激素和24种同位素标记内标，结合96孔板和自动化移液平台的使用，极大简化了前处理步骤操作和提高了通量，满足大批量样本的检测需求。
28、(2)本发明的检测方法覆盖类固醇激素代谢通路上的28个指标，涵盖孕激素、盐皮质激素、糖皮质激素、雌激素、雄激素和外源性激素，涉及广，满足一次实验对多种类固醇激素的检测。
29、(3)本发明的检测方法具有高特异性和高准确性，首先是通过色谱条件优化，将7组同分异构体及其他干扰物进行了基线分离，有效避免了同分异构体及其他干扰物对指标测定结果的影响；其次，将处理后的分析物根据固有质/荷比进行直接检测，非传统对衍生物的间接检测，方法特异性强；最后，引入24种d/13c/15n标记同位素作为内标定量，降低了不同基质间存在的基质效应对定量结果的影响。
30、(4)本发明提供的试剂盒，使用校准品制作标准曲线定量，低、中、高三个水平的质控品持续监测方法性能，可以更便捷地提供非医疗治疗目的的稳定、可靠的全代谢通路类固醇激素的检测。
31、(5)本发明的洗脱液a中加入nh4f，有利于提高本发明所测类固醇激素的负离子物质响应并改善峰型和分离度。
1.一种液相色谱质谱联用技术测定体液中多种类固醇激素的方法，其特征在于：向96孔板中加入包含类固醇激素的体液样品、同位素内标、盐析辅助试剂和萃取剂混合后进行萃取，萃取液经过浓缩，得待测样品；所述待测样品采用uplc-ms/ms进行检测；
2.根据权利要求1所述的一种液相色谱质谱联用技术测定体液中多种类固醇激素的方法，其特征在于：
3.根据权利要求2所述的一种液相色谱质谱联用技术测定体液中多种类固醇激素的方法，其特征在于：所述同位素内标包括d4-孕烯醇酮、黄体酮-d9、d7-11-脱氧皮质酮、皮质酮-d8、d7-醛固酮、[13c2；2h2]-17α-羟基孕烯醇酮、17α羟孕酮-d8、21-脱氧皮质醇-d8、11-脱氧皮质醇-[d5]、d4-皮质醇、可的松-[d7]、脱氢表雄酮-[d6]、脱氢表雄酮-[d6]硫酸钠盐、雄烯二酮-d7、d4-睾酮、双氢睾酮-d4、d4-雌酮、雌二醇-d4、雌三醇-d3、地塞米松-d4、18-羟基皮质酮-d4、18-羟基皮质醇-d4、11β-酮睾酮-d3和雄甾酮-[d4]中至少两种。
4.根据权利要求1～3任一项所述的一种液相色谱质谱联用技术测定体液中多种类固醇激素的方法，其特征在于：所述uplc-ms/ms的条件为：
5.根据权利要求4所述的一种液相色谱质谱联用技术测定体液中多种类固醇激素的方法，其特征在于：所述浓缩为经离心采用自动化平台移取上清液，氮吹、复溶，震荡离心；
6.根据权利要求5所述的一种液相色谱质谱联用技术测定体液中多种类固醇激素的方法，其特征在于：所述自动化平台使用遗传代谢样本前处理系统、空气置换式的移液模式，4通道自动化移液设备将上清液从萃取板转移到上机板中。
7.权利要求1～6任一项所述的一种液相色谱质谱联用技术测定体液中多种类固醇激素的试剂盒，其特征在于：包括洗脱液、同位素内标液、盐析辅助试剂、萃取剂、校准品稀释液、质控品、复溶液和色谱柱；
8.根据权利要求7所述的一种液相色谱质谱联用技术测定体液中多种类固醇激素的试剂盒，其特征在于：所述校准品稀释液由七个浓度的混合标准品溶液由校正线基质添加到混标工作液中稀释制得；
9.根据权利要求8所述的一种液相色谱质谱联用技术测定体液中多种类固醇激素的试剂盒，其特征在于：所述同位素内标液中，d4-孕烯醇酮、黄体酮-d9、d7-11-脱氧皮质酮、皮质酮-d8、d7-醛固酮、[13c2；2h2]-17α-羟基孕烯醇酮、17α羟孕酮-d8、21-脱氧皮质醇-d8、11-脱氧皮质醇-[d5]、d4-皮质醇、可的松-[d7]、脱氢表雄酮-[d6]、脱氢表雄酮-[d6]硫酸钠盐、雄烯二酮-d7、d4-睾酮、双氢睾酮-d4、d4-雌酮、雌二醇-d4、雌三醇-d3、地塞米松-d4、18-羟基皮质酮-d4、18-羟基皮质醇-d4、11β-酮睾酮-d3和雄甾酮-[d4]的浓度分别为4000、2000、100、2000、200、4000、2000、80、400、40000、8000、3000、800000、800、1000、500、200、400、80、2000、400、400、320、1600ng/dl。
