本发明涉及免疫化学，尤其是指一种分泌泛酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术：
1、泛酸(vb5)是一种水溶性b族维生素，能在体内转变成辅酶a或者酰基载体蛋白，参与糖、脂肪、蛋白质和能量代谢，是神经和大脑必需的营养物质，也是脂肪酸合成类固醇的必须物质；泛酸有助于体内类固醇的分泌，保持皮肤和头发的健康，同时，泛酸也可参与类固醇脂质、褪黑激素和亚铁血红素的合成；泛酸亦可帮助细胞的形成，维持中枢神经系统的正常发育；泛酸具有抗体制造功能，能帮助机体抵抗传染病，缓和多种抗生素副作用及毒性，并有助于减轻过敏症状。泛酸缺乏时，会导致低血糖、皮肤异常、疲倦失眠、食欲不振及消化不良等症状。术后病人、营养不良患者、妊娠哺乳期妇女都需要补充泛酸。泛酸广泛存在于多种食品，同时也是许多食品的添加剂。商业维生素补充剂和维生素强化食品已经成为解决这一缺陷的一种有效手段。因此，快速、准确、可靠地检测食品和维生素补充剂中的泛酸含量对质量控制是必要的。因此，有必要建立快速、精确的泛酸检测方法。
2、高效液相色谱法、气相色谱法、气相或液相色谱质谱联用法具有高灵敏度和准确的定性分析特点，但设备相对昂贵，需要专业操作人员进行样品分析。基于抗原抗体反应的免疫分析方法，具有操作简单、检测通量高的优点，可以满足现场快速检测的需要。然而，目前已经报道的泛酸免疫分析方法的特异性和检测灵敏度较差，无法满足泛酸快速精确检测的需求。因此，开发一种高特异性和检测灵敏度的泛酸单克隆抗体，并以此单克隆抗体开发一种高效检测泛酸的方法对实现泛酸的快速精准检测十分重要。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种分泌泛酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。本发明提供的杂交瘤细胞株分泌的泛酸单克隆抗体对泛酸具有很好的特异性和检测灵敏性，ic50值为25.67ng/ml；本发明以泛酸单克隆抗体制备得到定量检测泛酸的时间分辨荧光试纸条，结合荧光微球添加量的优化，得到的试纸条对泛酸的最低检测限为5.08μg/kg，线性检测范围为3.79-40.15μg/kg。本发明成果可用于食品中泛酸的快速定量检测，解决了目前泛酸免疫检测方法中特异性和检测灵敏度差的问题。
2、本发明的第一个目的是提供一种分泌泛酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2024年04月18日，保藏编号cgmccno.45919。
3、本发明的第二个目的是提供一种分泌泛酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，制备过程中使用的泛酸半抗原的分子结构式为：
4、
5、进一步地，泛酸半抗原的制备方法包括以下步骤：
6、称取4-(溴甲基)-苯乙酸苯甲酰甲基酯，将其溶解于20ml的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液中，称取泛酸加入到该溶液中，并向溶液中加入氟化钾，并于室温下搅拌2h。合并有机相，并用水洗涤，乙酸乙酯萃取，并经na2so4干燥，浓缩，得到黄色油状化合物。化合物溶解于ch3cooh溶液中，向其中加入锌粉，室温搅拌过夜。浓缩合并有机相，并通过制备柱纯化得到黄色油状化合物，即泛酸半抗原。
7、进一步地，泛酸完全抗原的制备方法包括以下步骤：
8、称取泛酸半抗原将其溶解在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，该混合物在室温搅拌6h，得到溶液a；称取牛血清蛋白bsa，溶解于碳酸盐缓冲液(cbs)稀释至3mg/ml，得到溶液b；随后，逐滴将溶液a加入到溶液b中，室温反应8h得到反应液，用pbs溶液透析反应液，除去未反应的小分子半抗原，得到泛酸完全抗原vb5-bsa。
9、进一步地，泛酸包被抗原的制备方法包括以下步骤：
10、称取泛酸半抗原将其溶解在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，该混合物在室温搅拌6h，得到溶液c；称取鸡卵白蛋白(ova)，溶解于碳酸盐缓冲液(cbs)中，得到溶液d；随后，逐滴将溶液c加入到溶液d中，室温反应8h得到反应液，用pbs溶液透析反应液，除去未反应的小分子半抗原，得到泛酸包被抗原vb5-ova。
11、进一步地，分泌泛酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法包括以下步骤：
12、步骤s1、制备泛酸半抗原，利用泛酸半抗原制备泛酸完全抗原，将所得泛酸完全抗原与完全弗氏佐剂混合得到含抗原完全弗氏佐剂，所得泛酸完全抗原和不完全弗氏佐剂混合得到含抗原不完全弗氏佐剂；
13、步骤s2、将步骤s1所得含抗原完全弗氏佐剂对免疫动物进行皮下免疫；
14、步骤s3、将步骤s2中免疫后的免疫动物使用步骤s1所得含抗原不完全弗氏佐剂进行加强免疫，并使用泛酸完全抗原进行冲刺免疫；
15、步骤s4、取步骤s3中进行冲刺免疫的免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合。
16、步骤s5、使用间接elisa法筛选出阳性细胞孔，选用泛酸为标准品，用间接elisa法对阳性细胞进行抑制效果测定，采用有限稀释法进行亚克隆，最终筛选出所述分泌泛酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
17、本发明的第三个目的是提供一种泛酸单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞株分泌所得。
18、进一步地，泛酸单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：
19、取8-10周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1ml，7天后每只小鼠腹腔注射1×106泛酸杂交瘤细胞，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化，纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
20、本发明的第四个目的是提供一种试纸条，所述试纸条包括上述泛酸单克隆抗体。
21、进一步地，所述试纸条包括底衬及设置于底衬上的样品垫、结合垫、包被膜和吸水垫(样品垫、结合垫、包被膜和吸水垫按照由上至下的顺序依次粘贴在底板上，且各部分有一定长度的重叠)；
22、结合垫，所述结合垫设置于样品垫与包被膜之间，且所述结合垫上修饰有带标记的泛酸单克隆抗体；
23、包被膜，所述包被膜上设有检测线和质控线；其中，检测线设于靠近结合垫的一端且固定有泛酸抗原，质控线设于远离结合垫的一端且固定有泛酸二抗；
24、吸水垫，所述吸水垫设置于所述包被膜远离结合垫的一端。
25、进一步地，所述试纸条包括时间分辨荧光试纸条。
26、进一步地，所述标记包括时间分辨荧光微球。
27、进一步地，修饰结合垫所用的时间分辨荧光微球的浓度为20-80μg/ml。
28、本发明的第五个目的是提供一种试剂盒，所述试剂盒中含有上述试纸条。
29、本发明的第六个目的是提供上述泛酸单克隆抗体、上述试纸条或上述试剂盒在检测泛酸中的应用。
30、本发明的上述技术方案相比于现有技术具有以下优点：
31、本发明所述杂交瘤细胞株分泌的泛酸单克隆抗体对泛酸具有更好的特异性和检测灵敏度(ic50值为25.67ng/ml)；以泛酸单克隆抗体制备得到定量检测泛酸的时间分辨荧光试纸条对泛酸的最低检测限为5.08μg/kg，线性检测范围为3.79-40.15μg/kg，在泛酸检测中具有更好的特异性和检测灵敏度，可用于食品中泛酸的快速精准定量检测。
32、生物材料保藏
33、分泌泛酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期为2024年04月18日，保藏编号为cgmcc no.45919。
1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为cgmcc no.45919。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，制备过程中使用的泛酸半抗原的分子结构式为：
3.一种泛酸单克隆抗体，其特征在于，所述泛酸单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌所得。
4.一种试纸条，其特征在于，所述试纸条包括权利要求3所述的泛酸单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括底衬及设置于底衬上的样品垫、结合垫、包被膜和吸水垫；
6.据权利要求5所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括时间分辨荧光试纸条。
7.根据权利要求6所述的试纸条，其特征在于，所述标记包括时间分辨荧光微球。
8.根据权利要求5所述的试纸条，其特征在于，修饰结合垫所用的时间分辨荧光微球的浓度为20-80μg/ml。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求4-8任一项所述的试纸条。
10.权利要求3所述的泛酸单克隆抗体、权利要求4-8任一项所述的试纸条或权利要求9所述的试剂盒在检测泛酸中的应用。
