本发明涉及生物医学研究领域，具体为一种用于噬血细胞淋巴组织细胞增多症病因分层诊断方法。
背景技术：
1、噬血细胞淋巴组织细胞增多症(hlh)又称噬血细胞综合征，是一种危及生命的高炎症综合征，由细胞毒性t淋巴细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞异常激活引起，导致高细胞血症和多器官免疫介导的损伤。作为一种综合征，hlh的临床表现各不相同，包括发热、器官肿大、全血细胞减少、消耗性凝血病、高甘油三酯血症和急性期反应物升高。血液病学/肿瘤学、传染病学、风湿病学/临床免疫学等不同领域的亚专科医生都面临着这一罕见的多方面综合征的挑战，因为患者通常会反复发热、全血细胞减少、肝功能异常和败血症样综合征，并可能迅速发展为终末期多器官功能衰竭。因此，尽管hlh是一种罕见疾病，但临床医生仍应了解hlh，因为早期识别可避免不可逆的器官损伤和随后的死亡。
2、hlh通常分为原发性(遗传性)和继发性(反应性)，其中原发性hlh是儿童患者的主要亚型，而继发性hlh则是成人患者中最常见的类型。继发性hlh通常由感染或恶性肿瘤引发，但也可由自身免疫性疾病和药物诱发。虽然hlh可发生于任何年龄，但大多数临床指南、前瞻性研究和治疗试验都侧重于儿科患者。hlh-94和hlh-2004治疗方案已被确立为诊断、分类和治疗18岁以下hlh患者的科学基石。2019年，组织细胞学会hlh指导委员会制定了成人hlh诊断和治疗建议。感染是hlh最常见的诱因，多种感染性病原体与hlh相关，主要是epstein-barr病毒(ebv)和巨细胞病毒(cmv)等病毒，也包括细菌、寄生虫和真菌。据报道，病毒感染是最常见的诱发因素，无论是健康人的原发感染还是免疫抑制患者的再激活，其中疱疹病毒占成人hlh病毒感染病例的62％，43％的病毒感染病例由ebv引起，9％的病毒感染病例由cmv引起。据报道，9％的成人hlh病例存在细菌感染，其中38％由结核病引起。寄生虫和真菌是hlh的罕见诱因，组织胞浆菌、利什曼原虫、疟原虫和弓形虫是最常见的报告病原体。尽管已报道的伴发hlh的感染有很多，但有些病例受到地理区域(利什曼病和蜱传疾病)、季节(流感病毒、蜱传疾病)和社会经济地位(结核病)的影响。成人hlh还与多种恶性肿瘤有关，包括t细胞或自然杀伤细胞淋巴瘤、b细胞淋巴瘤、白血病、霍奇金淋巴瘤、其他血液肿瘤、实体瘤和其他非特异性肿瘤。此外，hlh也可能在化疗期间发生，而且通常与感染有关。
3、由于hlh病因复杂，因此需要对疑似hlh患者进行全面评估和系统诊断。在临床实践中，一旦怀疑患者患有hlh，就应开始同时进行多项评估，应进行实验室和影像学检查，以收集确诊hlh综合征的支持性证据，并评估哪些器官系统受累以及受累的严重程度，还应对所有患者进行感染和恶性肿瘤评估，包括实验室检查、骨髓评估、全身影像学检查和任何可疑结果的活检。由于hlh是一种侵袭性和致命的综合征，因此早期诊断和病因鉴定对于开始适当的治疗、改善患者的生活质量和存活率至关重要。然而，由于传统的病因诊断耗时较长，有时还无法确定病原体，因此快速确定hlh的潜在感染病因具有挑战性。此外，传统的恶性肿瘤诊断也耗时长、阳性率低，而且由于采取侵入性措施，大大增加了患者的心理和经济负担。新兴的元基因组新一代测序(mngs)可能是一种潜在的最佳解决方案，有助于提高血液病潜在感染的临床诊断水平。由于mngs具有无偏见、快速和广泛的检测能力，它已被应用于许多与hlh相关的复杂感染病例，并成功鉴定了潜在的病原微生物。然而，传统的mngs只能用于快速鉴定与感染性疾病相关的病原体，或者仅在检测感染病原体时同步定性评估肿瘤可能性。然而，能否利用mngs产生的微生物数据和患者基因组信息对hlh患者进行病因学筛查和复杂病因分层诊断，尚无相关理论和临床应用研究，为本领域待解决的问题，故本发明提供一种用于噬血细胞淋巴组织细胞增多症病因分层诊断方法。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种用于噬血细胞淋巴组织细胞增多症病因分层诊断方法，以解决上述背景技术中提出的上述问题。
2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于噬血细胞淋巴组织细胞增多症病因分层诊断方法，包括以下步骤：
3、s1：采集多名继发性hlh患者的外周血样本，将每位继发性hlh患者进行病因临床分组；
4、s2：将外周血样本进行mngs检测，利用其数据开展后续的微生物和感染性病原体鉴定，以及基于人基因组序列的染色体拷贝数变异分析；
5、s3：对外周血样本进行dna提取和测序文库制备，其中，测序前使用分析仪结合定量pcr测量适配体评估dna的质量，对文库进行浓度调整，并在测序仪上使用单端(se)50碱基对(bp)测序策略进行ngs测序；
6、s4：通过样本获得测序数据，通过数据库比对，确定每个样本中存在的微生物物种；
7、s5：临床样本中检测到的所有微生物与平行ntc(无模板对照)中检测到的微生物(背景微生物)按每百万独特读数(rpm)参数进行比对和筛选，其中平行ntc中未检测到的微生物，以及rpm(临床样本)：rpm(平行ntc)>10的微生物被定义为临床样本中真实存在的微生物群，所述临床样本中真实存在微生物群的所有微生物物种都进行文献检索，对有文献报道会导致人类或哺乳类动物感染的微生物，都被定义为感染性病原体；
8、s6：异常cnv特征分析：将测序读数(reads)映射到ncbi数据库中的人类参考基因组(hg19)，只选择唯一比对的测序读数(reads)进行后续分析，参考基因组被分割成固定长度的连续窗口，计算每个窗口的读数深度，然后归一化为每个样本的读数总数，用归一化读数深度除以参考数据集的平均读数深度，得出每个窗口的拷贝数比，将拷贝数取log2，将具有相似比率的相邻窗口合并成片段，并标注染色体位置和平均比率，根据平均比率和相应染色体的正常拷贝数计算每个片段的拷贝数，然后与预设阈值进行比较，以验证cnv；
9、s7：统计分析：所有收集到的数据均使用r软件包进行统计分析，分类变量以频率和百分比表示，使用费雪精确检验进行比较，正态分布的连续测量数据以平均值的标准差或平均值的标准误差表示，非正态分布的数据以中位数(范围)表示，组间差异和显著性采用student t检验和wilcoxon秩和检验或kruskal-walli检验(非正态分布数据)计算，数据可视化在r中进行，α多样性指数包括香农指数、丰富度指数、辛普森指数和反辛普森指数，采用student t检验评估组间差异，beta多样性用无约束pcoa(主坐标分析)描述，相似性分析(anosim)用于检验组间差异，进行线性判别分析效应大小(lefse)分析，确定组间丰度差异显著的微生物，阈值为log10 lda(线性判别分析)得分≥2且p值≤0.05，在分析微生物的相对丰度之前，对微生物的rpm值进行对数变换，采用随机森林法构建预测模型，通过十倍交叉验证法确定分类的重要变量数，分类器的预测性能通过roc曲线进行分析。
10、优选的，所述步骤s1中，病因临床分组的病因包括ebv引发的hlh，恶性肿瘤引发的hlh，风湿性疾病引发的hlh以及其他病原体引发的hlh。
11、优选的，所述步骤s3中，分析仪为bioanalyzer 2100，测序仪为illuminanextseq550dx系统。
12、优选的，所述步骤s3中，对文库进行浓度调整以2000万(m)读数为目标。
13、优选的，所述步骤s4中，所述样本包括临床样本或平行ntc，原始数据经过滤后获得的清洁序列(reads)首先与ncbi数据库进行比对，确定每个样本中存在的微生物物种。
14、优选的，所述步骤s5中，通过在pubmed上进行文献检索。
15、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
16、建立了一种基于mngs数据的创新分析策略和方法，可以通过对mngs产生的患者染色体拷贝数变异(cnv)数据和微生物数据的整合分析和关键评估参数筛选，建立一套针对hlh患者进行感染、肿瘤和自身免疫等复杂病因分层诊断的临床评估模型，可对临床确诊的继发性hlh患者进行病因学精准筛查和辅助分层诊断，并大幅缩减疾病诊断的经济成本和时间成本，有助于临床精准诊疗和患者受益。
1.一种用于噬血细胞淋巴组织细胞增多症病因分层诊断方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种用于噬血细胞淋巴组织细胞增多症病因分层诊断方法，其特征在于：所述步骤s1中，病因临床分组的病因包括ebv引发的hlh，恶性肿瘤引发的hlh，风湿性疾病引发的hlh以及其他病原体引发的hlh。
3.根据权利要求1所述的一种用于噬血细胞淋巴组织细胞增多症病因分层诊断方法，其特征在于：所述步骤s3中，分析仪为bioanalyzer 2100，测序仪为illuminanextseq550dx系统。
4.根据权利要求1所述的一种用于噬血细胞淋巴组织细胞增多症病因分层诊断方法，其特征在于：所述步骤s3中，对文库进行浓度调整以2000万(m)读数为目标。
5.根据权利要求1所述的一种用于噬血细胞淋巴组织细胞增多症病因分层诊断方法，其特征在于：所述步骤s4中，所述样本包括临床样本或平行ntc，原始数据经过滤后获得的清洁序列(reads)首先与ncbi数据库进行比对，确定每个样本中存在的微生物物种。
6.根据权利要求1所述的一种用于噬血细胞淋巴组织细胞增多症病因分层诊断方法，其特征在于：所述步骤s5中，通过在pubmed上进行文献检索。
