本发明涉及工程菌，更具体的说是涉及一种基于雾化吸入的工程菌制剂及制备方法与应用。
背景技术：
1、目前，随着微生物肿瘤防治研究和临床应用的不断突破，利用合成生物学技术改造的可预测宿主免疫反应的工程化微生物制剂取得重要进展。已有研究报道，利用工程菌将肿瘤代谢产物(nh3)转化为l-精氨酸(l-arg)，肿瘤局部高浓度l-arg可增强抗细胞程序性死亡配体1(抗pd-l1)药物免疫治疗效率，有效避免口服或静脉注射l-arg的剂量毒性。另外，中国知易生物在研管线sk08(基于脆弱拟杆菌开发的活体生物药)联合抗细胞程序性死亡受体1/细胞程序性死亡配体1(抗pd-1/l1)单抗治疗晚期实体瘤的微生物联合用药方案也在国内开展临床试验。
2、利用自上而下的基因工程技术分解、设计、组装、构建的功能定制化工程菌活性生物药，一方面工程菌自身携带脂多糖、肽聚糖等固有免疫原性分子；另一方面工程菌可通过表达细胞因子(如白介素，il-12)，细胞毒性因子(如肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，trail)，抗肿瘤蛋白(如天青蛋白，laz)，前药物酶(如胞嘧啶脱氨酶)以及sirna(如sipd-1rna)等，靶向抗肿瘤获得性免疫反应的特定步骤，从而与固有免疫激活产生协同效应并重塑肿瘤免疫微环境，提高工程菌的抗肿瘤疗效。尽管工程菌协同递送免疫检查点抑制剂与抑炎细胞因子能够增加抗肿瘤效果，但是工程菌经静脉注射给药后，其他组织或器官的非特异性定植会引发全身性免疫治疗相关不良反应(iraes)，导致各器官的慢性损伤、功能受损，甚至功能丧失，影响患者预后。
3、因此，提供一种非静脉注射给药途径的工程菌递送系统是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提供了一种基于雾化吸入的工程菌制剂及制备方法与应用。
2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
3、一种基于雾化吸入的工程菌制剂，所述系统为工程菌-海藻酸钙-壳聚糖核壳微球；
4、所述工程菌含有免疫检查点抑制剂anti-pd-l1nanobody质粒与抗炎细胞因子il-10质粒，所述工程菌基因组整合同步裂解回路slic基因；
5、所述免疫检查点抑制剂anti-pd-l1nanobody核酸序列，如seq id no.1所示；
6、所述抗炎细胞因子il-10核酸序列，如seq id no.2所示。
7、进一步的，所述核壳微球为工程菌-海藻酸钙微球表面单包裹壳聚糖涂层；所述工程菌-海藻酸钙微球为工程菌表面单包裹海藻酸钙涂层。
8、进一步的，免疫检查点抑制剂anti-pd-l1nanobody质粒为p15a-j23119-anti-pd-l1nanobody，包括组成型启动子j23119、免疫检查点抑制剂anti-pd-l1nanobody基因；
9、所述抗炎细胞因子il-10质粒为prsf-j23119-il-10，包括组成型启动子j23119、抗炎细胞因子il-10基因。
10、进一步的，所述工程菌基因组整合同步裂解回路slic基因的方法为：
11、将ptd103luxi_sfgfp质粒执行裂解功能的slic基因片段整合在工程菌的caga位点上，将ptd103aiia(cm)质粒执行裂解功能的slic基因片段整合在工程菌的fhla位点上；
12、所述ptd103luxi_sfgfp质粒执行裂解功能的slic基因，核酸序列如seq id no.3所示；
13、所述ptd103aiia(cm)质粒执行裂解功能的slic基因，核酸序列如seq id no.4所示。
14、一种基于雾化吸入的工程菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
15、1)将自杀质粒pre112引入野生型大肠杆菌ecn，敲除ecn中存在的两个隐蔽质粒pmut1和pmut2，获得大肠杆菌ecnδδ菌株；利用red同源重组技术，改造ecnδδ，基因组整合同步裂解回路slic基因，构建具有同步裂解周期的底盘菌株ecn slic；
16、2)利用pcr技术分别将载体p15a和prsf线性化，并避开原有启动子区域；利用同源重组，将anti-pd-l1nanobody片段与p15a载体连接，构建的质粒p15a-j23119-anti-pd-l1nanobody；将il-10片段与prsf载体连接，构建的质粒prsf-j23119-il-10；
17、3)以大肠杆菌dh5α菌株为宿主进行质粒构建和扩增，以ecnδδslic菌株为宿主进行功能表征，获得产生anti-pd-l1nanobody和il-10的工程菌ecn slic”；
18、4)利用微流控设备批量生产工程菌凝胶微纳颗粒：
19、以工程菌ecn slic”与海藻酸盐混合溶液为内相，内相的比例cfu：m/v为1.0·108：1％；氯化钙溶液为外相制备凝胶单包覆工程菌颗粒，外相的氯化钙的浓度为5％；
20、采用自制的微流控装置合成双组分微球，该装置由两个注射泵控制，分别注射外相流体与内相流体，使外相流体剪切内相流体；内相注射泵流速为40μl/min，外相注射泵流速为1600μl/min，制备得工程菌-海藻酸钙微球；
21、将工程菌-海藻酸钙微球置于0.5％壳聚糖溶液中缓慢搅拌，所述工程菌-海藻酸钙微球与壳聚糖溶液的比例为m：v＝1mg：4ml，制备得单包覆的工程菌-海藻酸钙-壳聚糖核壳微球；
22、5)将工程菌-海藻酸钙-壳聚糖核壳微球冻干至含水量为4％，分散至生理盐水中，雾化为气溶胶颗粒，实现呼吸道给药功能。
23、6、根据权利要求5所述的一种基于雾化吸入的工程菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤5)所述冻干过程为，调整设置冻干机梯度冻干程序，梯度冻干温度程序为0℃、-20℃、-40℃，梯度冻干时间为30min、120min、360min。
24、进一步的，所述工程菌-海藻酸钙-壳聚糖核壳微球径为3-6μm。
25、一种基于雾化吸入的工程菌制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
26、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果为：
27、1、本发明基于呼吸道吸入工程菌的肺脏局部递送系统为一种工程菌-海藻酸钙-壳聚糖核壳微球，形貌均一，分散性好，可实现肺脏局部递送，同时释放工程菌药物，利用“工程菌同步裂解”实现外源工程菌药物中活性分子的精准释放，进一步实现对肺脏疾病的缓解与治疗。
28、2、本发明系统有望通过工程菌-海藻酸钙-壳聚糖核壳微球的呼吸道吸入，局部递送、病灶部位精准定植、肺脏黏膜免疫系统协同应答实现外源工程菌药物在宿主肺脏部位的靶向有效定植，进一步实现工程菌药物发挥免疫调控的时空精准性，从而最大程度实现对肺脏疾病的复发预防、原位治疗和病程抑制。
29、3、本发明基于呼吸道吸入工程菌肺脏局部递送系统通过局部定位、精准裂解、肺脏黏膜免疫系统协同应答实现外源工程菌药物对肺脏疾病的复发预防、原位治疗和病程抑制。本发明创新性地将“合成生物学-凝胶聚合技术”有机融合，开发了一套可实现外源工程菌药物在宿主肺脏内靶向有效定植的新策略。在此基础上精准调控工程菌分泌协同治疗因子，激活肺脏黏膜免疫。
30、4、本发明工程菌-海藻酸钙-壳聚糖核壳微球递送系统可实现智能化、精准化、可视化和无创化的外源工程菌药物高效递送；利用“雾化吸入技术”递送外源工程菌，实现外源工程菌药物在宿主肺脏的局部递送，实现工程菌药物的病灶靶向定植，进一步协同实现外源工程菌药物发挥免疫调控的时空精准性。
1.一种基于雾化吸入的工程菌制剂，其特征在于，所述系统为工程菌-海藻酸钙-壳聚糖核壳微球；
2.根据权利要求1所述的一种基于雾化吸入的工程菌制剂，其特征在于，所述核壳微球为工程菌-海藻酸钙微球表面单包裹壳聚糖涂层；所述工程菌-海藻酸钙微球为工程菌表面单包裹海藻酸钙涂层。
3.根据权利要求1所述的一种基于雾化吸入的工程菌制剂，其特征在于，免疫检查点抑制剂anti-pd-l1 nanobody质粒为p15a-j23119-anti-pd-l1nanobody，包括组成型启动子j23119、免疫检查点抑制剂anti-pd-l1 nanobody基因；
4.根据权利要求1所述的一种基于雾化吸入的工程菌制剂，所述工程菌基因组整合同步裂解回路slic基因的方法为：
5.权利要求1所述的一种基于雾化吸入的工程菌制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的一种基于雾化吸入的工程菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤5)所述冻干过程为，调整设置冻干机梯度冻干程序，梯度冻干温度程序为0℃、-20℃、-40℃，梯度冻干时间为30min、120min、360min。
7.根据权利要求5所述的一种基于雾化吸入的工程菌制剂的制备方法，其特征在于，所述工程菌-海藻酸钙-壳聚糖核壳微球径为3-6μm。
8.权利要求1所述的一种基于雾化吸入的工程菌制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
