本发明属于分子生物学，具体涉及一种抗human cd24单克隆抗体、其制备方法及其应用。
背景技术：
1、cd24是一种高度糖基化的蛋白质，通过糖基-磷脂酰肌醇与质膜相连，主要在免疫细胞上表达，比如b细胞、巨噬细胞和树突状细胞等。正常情况下，cd24可以促进b细胞的增殖和分化，也可以调节t细胞的活化和效应功能。此外，cd24在信号传导中也发挥着作用，主要由于其定位在脂筏上。有报道称，cd24的表达有可能影响了其它脂筏相关蛋白的功能或定位，例如cxcr4受体和β1-整合素，并且与src激酶家族存在着相互作用。此外，研究人员检测到一些肿瘤细胞过表达cd24蛋白，如宫颈癌、胆管癌、结直肠和胃癌等。在肿瘤细胞中，cd24也参与信号传递，这对于细胞的粘附、迁移和分化等功能至关重要。例如，cd24与p-选择素相互作用可能有助于乳腺癌细胞在内皮细胞上的滚动和与血小板的粘附，并促进卵巢癌细胞与间皮的粘附，从而增强肿瘤细胞的扩散。并且，卵巢癌、三阴性乳腺癌等细胞表面的cd24通过与巨噬细胞上的siglec-10结合具有抑制巨噬细胞吞噬的作用，从而实现免疫逃逸。囊泡的释放在肿瘤细胞上十分活跃。研究表明，在卵巢癌和乳腺癌的患者血清中检测到cd24阳性囊泡。
2、因此，在医学诊断中有可能通过cd24实现对肿瘤的检测。现有诊断检测试剂盒的核心试剂抗体不能自己生产，价格高，且质量和稳定性无法得到保障；有的试剂盒还受限于使用多克隆抗体，多抗供量有限且批间差异大，导致试剂盒质量不稳定，影响检测效果。如果开发一种高亲和力的抗human cd24单克隆抗体，可以为研究cd24在肿瘤细胞中的作用甚至是诊断提供支持。
3、开发抗human cd24单克隆抗体的方法中，最早以杂交瘤技术为主，也是应用最普遍的单克隆抗体开发平台，但是其耗时长且细胞融合效率低，并且可应用的物种有限。噬菌体展示技术虽然缩短了抗体开发时长，但由于不能保证轻重链的天然配对而影响了抗体的特异性、亲和力。
4、鉴于此，提出本发明。
技术实现思路
1、本发明的目的就是提供一种高亲和力的抗human cd24单克隆抗体、制备方法及其应用。
2、为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
3、在本发明的第一方面，提供了一种抗human cd24单克隆抗体，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区包括以下三个互补决定区cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3；
4、cdr-h1的氨基酸序列：ntymh(seq id no:1)；
5、cdr-h2的氨基酸序列：ridpangntkyapkfqg(seq id no:2)；
6、cdr-h3的氨基酸序列：edlktyyamdy(seq id no:3)；
7、优选地，所述的重链可变区氨基酸序列与seq id no:7所示氨基酸序列相同或具有至少90％序列同一性。
8、所述重链可变区氨基酸序列如seq id no:7所示。
9、evqlqqsvaelvrpgasvnlsctasgfnikntymhwvkqrpeqglewigridpangntkyapkfq gkatitadtssntaylqlssltsedtaiyycaredlktyyamdywgqgtsvtvss(seq id no:7)
10、在本发明的第二方面，提供了一种抗human cd24单克隆抗体的重链，所述的重链具有如本发明第一方面所述的重链可变区和重链恒定区。
11、在本发明的第三方面，提供了一种抗human cd24单克隆抗体的轻链可变区，所述抗体的轻链可变区包括以下三个互补决定区cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3；
12、cdr-l1的氨基酸序列：rasesvsihgthlmh(seq id no:4)；
13、cdr-l2的氨基酸序列：aasnles(seq id no:5)；
14、cdr-l3的氨基酸序列：qqsiedprt(seq id no:6)；
15、优选地，所述的轻链可变区氨基酸序列与seq id no:8所示氨基酸序列相同或具有至少90％序列同一性。
16、所述的轻链可变区氨基酸序列如seq id no:8所示。
17、divltqspaslavslgqratiscrasesvsihgthlmhwyqqkpgqppklliyaasnlesgvpar fsgsgsetdftlnihpveeedaatyfcqqsiedprtfgggtkleik。(seq id no:8)
18、在本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如本发明第三方面所述的轻链可变区和轻链恒定区。
19、在本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有如本发明第一方面所述的重链可变区，和/或如本发明第三方面所述的轻链可变区。
20、在另一优选例中，所述抗体具有如本发明第二方面所述的重链；和/或如本发明第四方面所述的轻链。
21、在另一优选例中，所述的抗体为特异性抗human cd24抗体的抗体。
22、在本发明的第六方面，提供了一种多核苷酸，它的编码选自如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体。
23、在本发明的第七方面，提供了一种载体，它含有如本发明第六方面所述的多核苷酸。
24、在本发明的第八方面，提供了一种宿主细胞，它含有如本发明第七方面所述的载体或本发明第六方面所述的多核苷酸。
25、在本发明的第九方面，提供了一种抗human cd24单克隆抗体的制备方法，具体制备过程如下：
26、s1.依据human cd24的蛋白序列信息(genbank：p25063)，在其c端连接human fc-tag，表达human cd24/hfc protein蛋白；
27、s2.用步骤s1获得的human cd24/hfc protein结合水溶性佐剂对小鼠进行快速免疫后，提取小鼠脾脏和骨髓细胞；
28、s3.以步骤s2获得的小鼠细胞为原材料，通过流式分选细胞仪进行阳性细胞分选，经过单细胞建库系统，构建抗体文库并进行二代测序；
29、s4.筛选步骤s3获得的抗体序列，提取轻重链天然配对的抗体序列，并克隆至载体中；
30、s5.通过哺乳动物细胞高通量表达系统诱导抗human cd24抗体高通量表达，获得抗human cd24的单克隆抗体；
31、s6.进行抗原结合实验和抗原抗体亲和力验证。
32、在另一优选例中，本发明所述抗原结合检测为elisa方法；所述抗原抗体亲和力检测为spr方法。
33、在本发明的第十方面，提供了如本发明第五方面所述的抗human cd24单克隆抗体在制备human cd24蛋白检测试剂中的应用。
34、在本发明的第十一方面，提供了如本发明第五方面所述的抗human cd24单克隆抗体在制备与human cd24蛋白结合的产品中的应用。
35、与现有技术相比，本发明的技术效果如下：本发明提供的单克隆抗体开发方法具有耗时短、通量高、阳性率高等优点，获得的单克隆抗体具有抗原结合活性好和亲和力强等优点。本发明以单个b细胞作为研究主体，利用流式细胞术分选出阳性细胞，采用单细胞抗体建库方法，保持了抗体轻重链的天然配对，并替代了效率低、耗时长且易受污染的杂交瘤细胞融合与培养。
1.一种抗human cd24单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区包括以下三个互补决定区cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3；
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的重链可变区氨基酸序列与seq id no:7所示氨基酸序列相同或具有至少90％序列同一性。
3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的轻链可变区氨基酸序列与seq id no:8所示氨基酸序列相同或具有至少90％序列同一性。
4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码选自如权利要求1-3任意一项所述的抗体。
5.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5所述的载体或权利要求4所述的多核苷酸。
7.如权利要求1-3任意一项所述的抗human cd24单克隆抗体，其制备方法如下：
8.如权利要求1-3任意一项所述抗human cd24单克隆抗体在制备human cd24蛋白检测试剂中的应用。
9.如权利要求1-3任意一项所述的抗human cd24单克隆抗体在制备与human cd24蛋白结合的产品中的应用。
