本发明属于生物，具体涉及保护b群脑膜炎球菌感染的外膜囊泡组合物及制法和应用。
背景技术：
1、脑膜炎奈瑟菌为一种革兰阴性双球菌，人是唯一的自然宿主，通常定植在人的鼻咽部。流行性脑脊髓膜炎是由脑膜炎奈瑟菌(或称脑膜炎球菌)neisseria meningitidis感染引起的一种全球性严重呼吸道传染病。在过去一百多年来，常在世界范围内引起周期性流行或散在发生流脑疫情，具有较高的发病率和病死率。根据细菌表面荚膜多糖的结构和抗原性差异，将其分为13个不同的血清群，其中多数病例是由a、b、c、w135和y群菌株引起的。
2、脑膜炎球菌细胞外膜是由外膜蛋白(omp)、脂蛋白及脂寡糖(lipooligosaccharide，los)组成的高分子复合物，在自然状态下成囊泡状结构，又称为外膜囊泡(omv)，其中主要具有免疫原性为
3、外膜蛋白。b群流脑菌株具有多样的表型和基因型特征，但往往引起爆发或流行的b群菌株可能属于某一个优势的克隆群。所以，单价omv疫苗很难保护和抵抗所有不同b群流脑菌株导致的疾病。
4、目前，人们在如何通过基因工程开发具有保护b群脑膜炎球菌感染的突变株方面，尚未研究清楚，由此使得开发具有高效保护b群脑膜炎球菌感染的突变株外膜囊泡方面的研究进展缓慢。因此，在此基础上开发相应的外膜囊泡组合物，更显得困难。
技术实现思路
1、针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种保护b群脑膜炎球菌感染的外膜囊泡组合物，该组合物的各组分在保护b群脑膜炎球菌感染方面具有协同作用。
2、为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
3、一种保护b群脑膜炎球菌感染的外膜囊泡组合物，所述外膜囊泡组合物由脂多糖修饰b群脑膜炎球菌的外膜囊泡和表达重组蛋白的b群脑膜炎球菌的外膜囊泡组成；
4、所述脂多糖修饰b群脑膜炎球菌的分类命名为奈瑟氏球菌neisseria sp.，保藏号为cgmccno.36402，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏时间为2024年7月19日；
5、所述表达重组蛋白的b群脑膜炎球菌的分类命名为脑膜炎奈瑟氏球菌neisseriameningitidis，保藏号为cgmcc no.31404，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏时间为2024年7月30日。
6、所述脂多糖修饰b群脑膜炎球菌是对b群脑膜炎球菌敲除lpta基因后在该基因处过表达lpxe基因后所得；
7、所述表达重组蛋白的b群脑膜炎球菌通过自转运系统hbp表达重组蛋白neisserial heparin binding antigen(nhba)、fhbp和neisseria adhesin a(nada)。
8、所述表达重组蛋白的b群脑膜炎球菌由以下方法制备而得：
9、(1)利用hbp蛋白自转运系统将nhba、fhbp和nada抗原的基因表达片段构建于质粒中；
10、(2)将质粒通过电转的方式转入b群脑膜炎球菌背景菌株中；
11、所述质粒的构建方法包括如下步骤：
12、1)将来源于b群脑膜炎球菌自身的hbp自转运系统表达盒利用gibson assemblykit组装试剂盒一步法克隆至载体pya3332中；
13、2)利用gibson assembly kit组装试剂盒将b群脑膜炎球菌抗原重组蛋白nhba、fhbp和nada的编码基因序列分别克隆至hbp自转运系统表达盒中，以实现将三种抗原表达至b群脑膜炎球菌外膜表面；
14、hbp自转运系统表达质粒载体的构建方法包括如下步骤：
15、1)引物设计：
16、hbp-f:5’ctgaccttggacgcgccaccggtttaag3’
17、hbp-r:5’aaccttgcgcgatgagcataagcgtacagcctg 3’
18、2)提取处于对数生长期的b群脑膜炎奈瑟菌基因组dna作为模板，以及以pya3332线性化质粒作为模板分别用对应引物进行扩增，分别得到对应片段的扩增产物，利用gibson assembly kit进行一步法克隆，将产物转化入大肠杆菌菌株top10中，得到重组质粒pya3332-hbp；
19、所述nhba、fhbp和nada抗原的表达质粒的构建方法包括如下步骤：
20、1)引物设计：
21、nhba-f:5’tgctgacaaagaactgggatgtttgaacgcagtgtgattg3’
22、nhba-r:5’gaaacagttcctgagtctcaatcctgctctttttt3’
23、fhbp-f:5’tgccaccctgagtctgaacaggtgaaccgaactgccttctgctgc3’
24、fhbp-r:5’cgctgttacgacgcattgagattattgcttggcttcaagacc3’
25、nada-f:5’tgccaccctgagtctgaacagcatgcaaaccgccgccgccgctc3’nada-r:5’cgctgttacgacgcattgagactcaggcgggtcccatgcc3’
26、pya3332-hbp-nhba-f:5’caatcacactgcgtttgacgtaactgacgattgc3’
27、pya3332-hbp-nhba-r:5’aaaaagagcaggattgcagtaaaccttggcgacgtg3’
28、pya3332-hbp-fhbp-f:5’gcagcagaaggcagagcgccggcctgaaggtaatc3’
29、pya3332-hbp-fhbp-r:5’ggtcttgaagccaagctgcgccgagagcgattga3’
30、pya3332-hbp-nada-f:5’gagcggcggcggcggttaagcgccggcctgaaggta atc3’
31、pya3332-hbp-nada-r:5’ggcatgggacccgcctgagcgccgagagcgattga3’
32、2)利用引物nhba-f和nhba-r以b群脑膜炎奈瑟菌为模板扩增nhba对应的序列，利用引物pya3332-hbp-nhba-f和pya3332-hbp-nhba-r以pya3332-hbp为模板扩增载体片段，分别得到对应片段的扩增产物，利用gibson assembly kit进行一步法克隆，将产物转化入大肠杆菌菌株top10中，得到重组质粒pya3332-hbp-nhba；
33、3)利用引物fhbp-f和fhbp-r以b群脑膜炎奈瑟菌为模板扩增fhbp对应的序列，利用引物pya3332-hbp-fhbp-f和pya3332-hbp-fhbp-r以pya3332-hbp-nhba为模板扩增载体片段，分别得到对应片段的扩增产物，利用gibson assembly kit进行一步法克隆，将产物转化入大肠杆菌菌株top10中，得到重组质粒pya3332-hbp-nhba-fhbp；
34、4)利用引物nada-f和nada-r以b群脑膜炎奈瑟菌为模板扩增fhbp对应的序列，利用引物pya3332-hbp-nada-f和pya3332-hbp-nada-r以pya3332-hbp-nhba-fhbp为模板扩增载体片段，分别得到对应片段的扩增产物，利用gibson assembly kit进行一步法克隆，将产物转化入大肠杆菌菌株top10中，得到重组质粒pya3332-hbp-nhba-fhbp-nada。
35、具体地，所述脂多糖修饰b群脑膜炎球菌，是通过同源重组的方法，将强制表达磷酸基团合酶lpxe的基因lpxe构建至敲除lpta基因的上下游同源臂之间，形成敲除lpta同时表达lpxe的基因型，得到具有可高效激活tlr4受体的最优lipid a结构的b群脑膜炎球菌突变株；
36、所述同源重组过程中，所用的质粒pre112-lpta/ptrc-lpxe的构建方法如下：
37、根据genbank上序列号为nz_lr134326.1的基因序列，设计在lpta同源臂中间插入lpxe序列，引物如下：
38、lpta-3f：5’tgagacgctgacgataattgc3’
39、lpta-3r：5’cgatgaaatttgcgcgatgacg3’
40、lpxe-1f：5’ccgagactttgacgtagacgtgacgtgacgatgacg3’
41、lpxe-1r：5’cgacgatagcgatgacgattgacgattaaccgt3’；
42、提取处于对数生长期的bordetella bronchiseptica参考菌株的基因组dna作为模板，分别利用lpxe-1f和lpxe-1r扩增lpxe全长片段，随后以pre112-lpta质粒为模板，利用lpta-3f和lpta-3r扩增产物，随后将两段pcr产物利用一步法克隆方法，将反应产物电转入大肠杆菌工程菌感受态χ7232中，得到重组质粒pre112-lpta/ptrc-lpxe。
43、优选地，所述脂多糖修饰b群脑膜炎球菌的外膜囊泡和表达重组蛋白的b群脑膜炎球菌的外膜囊泡的重量比为2:1。
44、本发明还提供了上述外膜囊泡组合物的制备方法，所述外膜囊泡组合物是将上述脂多糖修饰b群脑膜炎球菌的外膜囊泡和表达重组蛋白的b群脑膜炎球菌的外膜囊泡混合而得。
45、本发明还提供了上述组合物在制备保护b群脑膜炎球菌感染药物方面的应用。具体地，所述组合物作为保护b群脑膜炎球菌感染的疫苗使用。
46、如本发明的实施例所示，在制备脂多糖修饰b群脑膜炎球菌时，仅敲除lipid a合成相关基因lpta或者敲除lpta同时表达pagl的突变株所得的外膜囊泡所产生的免疫保护水平均明显差于本发明所得菌株的外膜囊泡。本发明在所得脂多糖修饰b群脑膜炎球菌的基础上，发现将本发明的表达重组蛋白的b群脑膜炎球菌的外膜囊泡与脂多糖修饰b群脑膜炎球菌的外膜囊泡进行组合，可以显著的增强保护b群脑膜炎球菌感染的效果。因此，本发明极大的提高了脂多糖修饰b群脑膜炎球菌的使用价值。
47、本发明的有益效果：
48、本发明所提供的外膜囊泡组合物，相对于单菌株的外膜囊泡而言，具有更好的保护b群脑膜炎球菌感染的效果，更适于作为疫苗使用。
1.一种保护b群脑膜炎球菌感染的外膜囊泡组合物，其特征在于，所述外膜囊泡组合物由脂多糖修饰b群脑膜炎球菌的外膜囊泡和表达重组蛋白的b群脑膜炎球菌的外膜囊泡组成；
2.根据权利要求1所述的一种保护b群脑膜炎球菌感染的外膜囊泡组合物，其特征在于，所述脂多糖修饰b群脑膜炎球菌是对b群脑膜炎球菌敲除lpta基因后在该基因处过表达lpxe基因后所得；
3.根据权利要求2所述的一种保护b群脑膜炎球菌感染的外膜囊泡组合物，其特征在于，所述表达重组蛋白的b群脑膜炎球菌由以下方法制备而得：
4.根据权利要求3所述的一种保护b群脑膜炎球菌感染的外膜囊泡组合物，其特征在于，所述脂多糖修饰b群脑膜炎球菌，是通过同源重组的方法，将强制表达磷酸基团合酶lpxe的基因lpxe构建至敲除lpta基因的上下游同源臂之间，形成敲除lpta同时表达lpxe的基因型，得到具有可高效激活tlr4受体的最优lipid a结构的b群脑膜炎球菌突变株；
5.根据权利要求1所述的一种保护b群脑膜炎球菌感染的外膜囊泡组合物，其特征在于，所述脂多糖修饰b群脑膜炎球菌的外膜囊泡和表达重组蛋白的b群脑膜炎球菌的外膜囊泡的重量比为2:1。
6.一种保护b群脑膜炎球菌感染的外膜囊泡组合物的制备方法，其特征在于，所述外膜囊泡组合物是将权利要求1～5所述的脂多糖修饰b群脑膜炎球菌的外膜囊泡和表达重组蛋白的b群脑膜炎球菌的外膜囊泡混合而得。
7.权利要求1～5任一项所述组合物在制备保护b群脑膜炎球菌感染药物方面的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述组合物作为保护b群脑膜炎球菌感染的疫苗使用。
