本发明属于聚合物胶束，特别涉及一种叶酸修饰的ph/还原双响应含硒混合聚合物交联胶束及其制备方法与应用。
背景技术：
1、癌症严重威胁着人类的健康，是人类死亡的主要原因之一，而传统化疗药物在临床应用和疗效方面，一直存在局限性，如药物在体内运输出现较差的溶解性、显著的毒副作用、易发生降解、不良的药物动力学特性以及缺乏对特定组织的靶向选择性等，导致需要高剂量、连续滴注给药，杀死癌症细胞的同时，也杀死大量的正常细胞。为解决上述限制，药物递送系统(drugdelivery system，dds)可依据药物分子的属性，挑选适当的载体材料和剂型，通过合理设计实现精确、便捷的给药技术，将药物输送至生物体内，以实现最优的生物利用率和治疗效果。为了提高药物在体内的利用率和减少毒副作用，开发优异的dds就成为了目前医学和药学中的研究热点。
2、智能响应的纳米聚合物载药胶束，可灵活携载抗肿瘤药物克服生理病理屏障，完成持续靶向递送和控制释放，实现抗肿瘤药物减毒增效作用，是当前新型药物递送系统的重点研发方向之一。它利用两亲性聚合物在溶液中自组装形成核/壳结构的纳米颗粒，疏水内核可包载疏水性药物、提高药物溶解度；亲水外壳稳定和保护胶束，可降低药物在人体正常组织的毒副作用，避免体内网状内皮系统的吞噬或肝脾肾脏等组织的吸收清除。对聚合物胶束进行功能性改性，如引入刺激响应基团或修饰靶向配体等，利用人体正常细胞微环境(ph≈7.4，36-37℃，低gsh)与肿瘤组织微环境(ph≈5.0-6.5，37-42℃，高gsh，蛋白质/酶/受体过度表达等)的差异，可赋予其智能响应和主动靶向等特性，实现抗癌药物的有效靶向递送和控制释放。
3、智能响应的聚合物胶束作为应用前景优越的疏水性药物递送系统，其表面易于进行功能化修饰，能有效提升疏水性药物的生物利用度和减少药物毒副作用。然而，尽管各种聚合物胶束在抗癌药物的递送研究已取得巨大进展，这种智能药物递送系统仍然存在如下不足：(1)制备技术方面，单分子结构类型设计单一、多功能嵌段导致聚合物链过长，合成路线繁杂等；(2)控释性能方面，载体在血液循环中稳定性不高，在肿瘤环境中靶向定位精准释放效率低，目标环境响应缓慢等。
技术实现思路
1、为了克服上述现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种叶酸修饰的ph/还原双响应含硒混合聚合物交联胶束。
2、本发明的另一目的在于提供一种上述叶酸修饰的ph/还原双响应含硒混合聚合物交联胶束的制备方法。
3、本发明的又一目的在于提供上述叶酸修饰的ph/还原双响应含硒混合聚合物交联胶束的应用，所述含硒混合聚合物交联胶束作为疏水性抗癌药物的载体，解决了现有技术中聚合物载药胶束稳定性、药物控释、靶向性能和制备技术还有待提高的技术问题。
4、本发明的目的通过下述技术方案实现：
5、一种叶酸修饰的ph/还原双响应含硒混合聚合物交联胶束，所述混合聚合物交联胶束是由叶酸修饰的聚合物p1-sa和以聚已内酯为内核的聚合物p2-sa混合交联自组装形成；聚合物p1-sa为fa-peg-(phema-g-sa)-pdeaema，其结构式如式(1)所示，其中x为30～40的正整数，y为10～20的正整数，z为30～40的正整数；聚合物p2-sa为pcl-(phema-g-sa)-pegma，其结构式如式(2)所示，l为50～70的正整数，m、n为10～20的正整数：
6、
7、所述聚合物p1-sa的数均分子量为13500～20000g/mol；所述聚合物p2-sa的数均分子量为13600～22500g/mol。
8、上述的一种叶酸修饰的ph/还原双响应含硒混合聚合物交联胶束的制备方法，包括以下步骤：
9、(1)在氩气氛围下，将聚乙二醇、溶剂以及缚酸剂混合后冰浴，加入2-溴异丁酰溴，低温下搅拌，进行溴化反应，得到溴化后的聚乙二醇(peg-ibubr)；
10、(2)将步骤(1)所得溴化后的聚乙二醇(peg-ibubr)、叶酸(fa)、脱水剂、溶剂以及第一催化剂混合后，抽气-充入氮气三次，室温下搅拌，进行酯化反应，去离子水透析，得到接枝叶酸的聚乙二醇(fa-peg-ibubr)；
11、(3)将步骤(2)所得接枝叶酸的聚乙二醇(fa-peg-ibubr)、第二催化剂混合后，抽气-充入氮气三次，加入溶剂、甲基丙烯酸羟乙酯、配体以及还原剂，进行arget atrp(电子转移活化再生原子转移自由基聚合)一次反应，再加入甲基丙烯酸二乙氨基乙酯，进行arget atrp二次反应，得到ph响应性聚合物fa-phema-pdeaema(p1)；
12、(4)将步骤(3)所得ph响应性聚合物fa-phema-pdeaema、脱水剂、溶剂以及第一催化剂混合后，抽气-充入氮气三次，室温下搅拌，加入硒辛酸(sa)进行酯化反应，去离子水透析，过滤、冷冻干燥得到聚合物fa-peg-(phema-g-sa)-pdeaema，即为聚合物p1-sa；
13、(5)在氩气氛围下，将1-丁醇、ε-己内酯、溶剂以及催化剂混合后，130℃搅拌24h，进行rop开环聚合反应，得到聚己内酯(pcl)；
14、(6)在氩气氛围下，将步骤(5)所得聚己内酯、溶剂以及缚酸剂混合后冰浴，加入2-溴异丁酰溴，低温下搅拌，进行溴化反应，得到溴化后的聚己内酯(pcl-ibubr)；
15、(7)将步骤(6)所得溴化后的聚己内酯(pcl-ibubr)、第二催化剂混合后，抽气-充入氮气三次，加入溶剂、甲基丙烯酸羟乙酯、配体以及还原剂，进行arget atrp一次反应，再加入聚乙二醇单甲醚单甲基丙烯酸酯，进行arget atrp二次反应，得到聚合物pcl-phema-ppegma(p2)；
16、(8)将步骤(7)所得聚合物pcl-phema-ppegma、脱水剂、溶剂以及第一催化剂混合后，抽气-充入氮气三次，室温下搅拌，加入硒辛酸(sa)进行酯化反应，去离子水透析，过滤、冷冻干燥得到聚合物pcl-(phema-g-sa)-pegma，即为聚合物p2-sa；
17、(9)将质量比1:1的步骤(4)所得聚合物p1-sa和步骤(8)中所得聚合物p2-sa一起溶于dmso中，去离子水中透析，得到空白混合非交联胶束透析液；空白混合非交联胶束透析液通过过滤和冷冻干燥后得到空白混合非交联胶束粉末；
18、(10)将步骤(9)所得空白混合非交联胶束透析液，调节ph至8.5，加入还原剂，使胶束发生自交联反应，随后继续透析，得到叶酸修饰的ph/还原双响应含硒混合聚合物交联胶束透析液，透析液通过过滤和冷冻干燥得到叶酸修饰的ph/还原双响应含硒混合聚合物交联胶束粉末。
19、步骤(1)和步骤(6)中所述缚酸剂为三乙胺，所述溶剂为四氢呋喃，所述溴化反应的温度为0℃，所述溴化反应的时间为3h；
20、步骤(2)、步骤(4)和步骤(8)中所述脱水剂为二环己基碳二亚胺，所述第一催化剂为二甲氨基吡啶，所述溶剂为二甲基亚砜，所述酯化反应时间为24h，所述去离子水透析的时间为48h；
21、步骤(3)和步骤(7)中所述第二催化剂为溴化铜，所述配体是五甲基二乙烯三胺，所述还原剂是异辛酸亚锡，所述arget atrp一次反应的时间为6h，所述arget atrp二次反应的时间为8h；所述arget atrp一次反应和arget atrp二次反应的温度为70℃；
22、步骤(10)中所述透析的介质为pbs溶液，透析的时间为48小时；
23、步骤(10)中所述还原剂为二硫苏糖醇(dtt)，所述自交联反应的时间为24小时，所述透析的时间为48小时。
24、步骤(3)所述arget atrp二次反应之后，以及步骤(6)所述溴化反应之后，还进行了浓缩、沉淀、过滤、干燥最终得到产物；所述沉淀是将浓缩后的样品溶解于少量的四氢呋喃中，再将此溶液转入10倍体积量的冰正己烷中进行沉淀。
25、步骤(5)所述溶剂为四氢呋喃，所述催化剂为异辛酸亚锡。
26、步骤(4)所述聚合物p1-sa的制备原料包括：5质量份ph响应性聚合物fa-phema-pdeaema、0.44质量份硒辛酸(sa)、0.41质量份脱水剂、0.024质量份第一催化剂。
27、步骤(8)所述聚合物p2-sa的制备原料包括：5质量份聚合物pcl-phema-ppegma、0.44质量份硒辛酸(sa)、0.41质量份脱水剂、0.024质量份第一催化剂。
28、步骤(10)所述还原剂的用量为步骤(4)所得聚合物p1-sa和步骤(8)中所得聚合物p2-sa总摩尔数的10％。
29、优选的，所述聚合物p1-sa的数均分子量为14785g/mol；所述聚合物p2-sa的数均分子量为18055g/mol。
30、优选的，所述步骤(1)中，溴化反应之后还包括：用稀盐酸、碳酸氢钠、水依次洗涤，逐滴加入正己烷中沉淀，最终得到溴化后的聚乙二醇(peg-ibubr)。
31、优选的，所述步骤(1)中，溴化反应之后还包括：浓缩、沉淀、过滤、干燥，最终得到溴化后的聚乙二醇(peg-ibubr)；所述沉淀是将浓缩后的产物溶解于少量的二氯甲烷中，再将此溶液转入10倍体积量的正己烷中进行沉淀。
32、步骤(1)所述溴化的聚乙二醇的制备原料包括：10质量份聚乙二醇，0.46质量份2-溴异丁酰溴，0.40质量份三乙胺。
33、步骤(2)所述接枝叶酸的聚乙二醇(fa-peg-ibubr)的制备原料包括：5质量份peg-ibubr、0.44质量份叶酸(folic acid)、0.41质量份脱水剂、0.024质量份第一催化剂。
34、步骤(3)所述ph响应性聚合物fa-phema-pdeaema(p1)的制备原料包括：2.40质量份fa-peg-ibubr、0.012质量份第二催化剂、1.30质量份甲基丙烯酸羟乙酯、0.086质量份五甲基二乙烯三胺、0.20质量份还原剂、3.70质量份甲基丙烯酸二乙氨基乙酯。
35、步骤(5)所述聚己内酯(pcl)的制备原料包括：7.99质量份ε-己内酯，0.12质量份1-丁醇，0.08质量份催化剂异辛酸亚锡。
36、步骤(6)所述溴化后的聚己内酯(pcl-ibubr)的制备原料包括：8质量份聚己内酯，0.23质量份2-溴异丁酰溴，0.20质量份缚酸剂。
37、步骤(7)所述聚合物pcl-phema-ppegma(p2)的制备原料包括：8质量份溴化后聚己内酯(pcl-ibubr)，0.012质量份第二催化剂、1.30质量份甲基丙烯酸羟乙酯、0.086质量份五甲基二乙烯三胺、0.20质量份异辛酸亚锡、3.70质量份聚乙二醇单甲醚单甲基丙烯酸酯。
38、上述的一种叶酸修饰的ph/还原双响应含硒混合聚合物交联胶束在递送抗癌药物中作为药物载体的应用。
39、需要说明的是，本发明提供的叶酸修饰的ph/还原双响应含硒混合聚合物交联胶束具有较低的临界胶束浓度，在水溶液中能够自组装形成聚合物胶束，应用于包载抗癌药物。
40、优选的，所述抗癌药物为疏水性抗癌药物。
41、本发明提供的叶酸修饰的ph/还原双响应含硒混合聚合物交联胶束中包括了疏水嵌段，适用于疏水药物的负载，可对疏水性抗癌药物起到增溶作用，提高聚合物胶束的载药能力。
42、叶酸修饰的ph/还原双响应含硒混合聚合物交联载药胶束，按照以下方法制备得到：将叶酸修饰的ph/还原双响应含硒混合聚合物交联胶束和疏水性抗癌药物以质量比2:1的比例溶于有机溶剂中，搅拌4～12h后用去离子水透析48h，每隔4h更换一次去离子水，更换三次后每隔12h换一次去离子水，然后冷冻干燥，得到叶酸修饰的ph/还原双响应含硒混合聚合物交联载药胶束。
43、需要说明的是，当含硒混合聚合物交联胶束与疏水性抗癌药物配比为2:1时，能获得粒径均匀分布的且能保持较高载药量的聚合物载药胶束。
44、综上所述，本发明叶酸修饰的ph/还原双响应含硒混合聚合物交联胶束由聚合物p1-sa和p2-sa自组装形成，其结构中包括聚己内酯(pcl)、甲基丙烯酸n,n二乙氨基乙基酯(deaema)、聚乙二醇(peg)、聚乙二醇单甲醚单甲基丙烯酸酯(pegma)、甲基丙烯酸羟乙酯(phem)、叶酸(fa)和硒辛酸(sa)。其中，peg、pegma为亲水嵌段，具有良好的水溶性，能够延长胶束在正常血液环境中的循环时间；pcl、deaema为疏水嵌段，从而可改善胶束对疏水性药物的载药量；deaema中的叔氨基作为ph响应基团，在肿瘤组织的微酸性条件下，使deaema的叔氨基出现质子化作用，由完全疏水逐渐变为部分亲水，导致疏水内核溶胀，从而释放出负载于疏水内核内部的药物。phem结构含有端羟基，可以修饰硒辛酸。硒辛酸五元环中的二硒键，使用微量dtt可开环自交联；同时，二硒键具有还原响应性，在肿瘤组织的高gsh浓度环境下，可被还原断键，从而加速药物释放。fa可以被肿瘤细胞表面的叶酸受体主动识别，可以提供胶束的主动靶向性。因此，本发明申请提供的叶酸修饰的ph/还原双响应含硒混合聚合物交联胶束，同时具备主动靶向性、ph/还原双响应性，其聚合物制备路线简短，合成难度较低。本发明申请所制备的载药胶束，在正常细胞内微环境条件中可稳定存在、漏药少，而在肿瘤部位能被肿瘤细胞主动识别、堆积内吞，顺利释放药物，并且具有非免疫性、非抗原性、非毒性和对大部分蛋白质无污染等优点，可解决现有技术中聚合物载药胶束稳定性、药物控释、靶向性能和制备技术还有待提高的技术问题。
45、本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：
46、本发明设计并合成了一种叶酸修饰的ph/还原双响应含硒混合聚合物交联胶束，其粒径均匀分布且载药量较高。为降低多功能聚合物载体的合成难度，采用混合胶束的策略来制备胶束。以微量二硫苏糖醇引发其自交联制成载药交联胶束后，相比非交联的载药胶束，稳定性明显提高，并且同时具备主动靶向性和ph/还原双重响应性。该载药交联胶束，可在中性环境下长期稳定存在，漏药少；而在肿瘤部位能被肿瘤细胞主动识别、堆积内吞，并顺利释放药物。因此，本发明所制备的叶酸修饰的ph/还原双响应含硒混合聚合物交联胶束可解决当前智能响应聚合物载药胶束的稳定性差、靶向性弱和药物控释能力不高的技术问题，并降低多功能载体材料的合成难度。
1.一种叶酸修饰的ph/还原双响应含硒混合聚合物交联胶束，其特征在于：所述混合聚合物交联胶束是由叶酸修饰的聚合物p1-sa和以聚已内酯为内核的聚合物p2-sa混合交联自组装形成；聚合物p1-sa为fa-peg-(phema-g-sa)-pdeaema，其结构式如式(1)所示，其中x为30～40的正整数，y为10～20的正整数，z为30～40的正整数；聚合物p2-sa为pcl-(phema-g-sa)-pegma，其结构式如式(2)所示，其中l为50～70的正整数，m、n为10～20的正整数：
2.根据权利要求1所述的一种叶酸修饰的ph/还原双响应含硒混合聚合物交联胶束，其特征在于：所述聚合物p1-sa的数均分子量为13500～20000g/mol；所述聚合物p2-sa的数均分子量为13600～22500g/mol。
3.根据权利要求1所述的一种叶酸修饰的ph/还原双响应含硒混合聚合物交联胶束的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的一种叶酸修饰的ph/还原双响应含硒混合聚合物交联胶束的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述聚合物p1-sa的制备原料包括：5质量份ph响应性聚合物fa-phema-pdeaema、0.44质量份硒辛酸(sa)、0.41质量份脱水剂、0.024质量份第一催化剂。
5.根据权利要求3所述的一种叶酸修饰的ph/还原双响应含硒混合聚合物交联胶束的制备方法，其特征在于：步骤(8)所述聚合物p2-sa的制备原料包括：5质量份聚合物pcl-phema-ppegma、0.44质量份硒辛酸、0.41质量份脱水剂、0.024质量份第一催化剂。
6.根据权利要求3所述的一种叶酸修饰的ph/还原双响应含硒混合聚合物交联胶束的制备方法，其特征在于：步骤(10)所述还原剂的用量为步骤(4)所得聚合物p1-sa和步骤(8)中所得聚合物p2-sa总摩尔数的10％。
7.根据权利要求1或2所述的一种叶酸修饰的ph/还原双响应含硒混合聚合物交联胶束在递送抗癌药物中作为药物载体的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述叶酸修饰的ph/还原双响应含硒混合聚合物交联胶束作为药物载体，将叶酸修饰的ph/还原双响应含硒混合聚合物交联胶束和疏水性抗癌药物以质量比2:1的比例溶于有机溶剂中，搅拌4～12h后用去离子水透析48h，每隔4h更换一次去离子水，更换三次后每隔12h换一次去离子水，然后冷冻干燥，得到叶酸修饰的ph/还原双响应含硒混合聚合物交联载药胶束。
