本发明属于微生物发酵培养，具体涉及一种针对微生物工业发酵中噬菌体污染的防治方法。
背景技术：
1、噬菌体（phages），也称作细菌病毒，其是一种专门感染细菌、真菌、藻类和土壤微生菌的病毒。噬菌体的结构类似于哺乳动物的病毒，通常有一个蛋白质外壳包裹着遗传物质，遗传物质可以是dna或rna。噬菌体的种类繁多，科学家估计每种细菌周围至少有一个噬菌体能够感染它。
2、噬菌体的生活周期可分为两种类型：裂解（lytic）和溶菌（lysogenic）。裂解型噬菌体侵入宿主细胞后，会快速复制其遗传物质，制造多个蛋白质外壳，最终导致宿主细胞裂解，释放出多个新的噬菌体粒子，去感染其他细胞。而溶菌型噬菌体的基因会整合到宿主细胞的染色体上，随着宿主细胞的繁殖，噬菌体的基因也会被复制，但宿主细胞不会立即裂解。在某些条件下，比如受到紫外线照射或受到其他压力时，噬菌体会从宿主的染色体中释放出来，进入裂解周期。
3、在微生物发酵过程中，噬菌体的存在会对微生物的生长、发酵效率和产物品质产生影响，主要包括以下方面：1）噬菌体对微生物的感染可能导致细胞溶解并释放细胞内成分，这不仅会降低发酵液中微生物细胞的数量，还会导致溶解物质对发酵过程产生影响，一些噬菌体可能携带基因，可导致细菌产生毒素或其他有害物质，对发酵过程中产物的纯度和质量造成负面影响；2）噬菌体污染还可能导致发酵过程中的不稳定性，当噬菌体在发酵液中大量复制时，可能会导致细菌数量的快速减少，从而影响发酵效率和最终产物的产量，从而影响发酵过程的稳定性；3）噬菌体污染还存在一定的生物安全风险，如果发酵液中存在噬菌体污染，特别是当发酵产物用于食品、医药等领域时，噬菌体可能会对人体健康造成潜在威胁。
4、因此，有必要提供一种针对微生物工业发酵中噬菌体污染的防治方法来解决现有技术中存在的不足。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种针对微生物工业发酵中噬菌体污染的防治方法。本发明中，使用碱性蛋白酶对发酵环境进行处理，能减少噬菌体的污染，同时优化发酵过程中的培养基组分，能进一步减少噬菌体的污染；通过上述两方面处理的协同作用，能显著减少微生物发酵中的噬菌体污染，并且提高发酵稳定性和发酵产物的产量。
2、在第一方面，本发明提供了一种针对微生物工业发酵中噬菌体污染的防治方法，包括如下步骤：使用碱性蛋白酶溶液对发酵环境进行消杀处理，得到干净的发酵环境；向干净的发酵环境中的发酵罐中加入发酵培养液，然后接入种子培养液后，进行发酵培养，得到初始发酵液；向初始发酵液中继续加入补料培养液，继续进行发酵培养，得到发酵产物；其中，发酵培养液包括碳源10-20g/l、有机氮源10-20g/l、铵盐5-15g/l，磷酸二氢钾4-8g/l、磷酸氢二钾2-5g/l、硫酸镁0.5-1g/l、硫酸锰0.01-0.05g/l，ph为6.5-7.5。
3、本发明提供的发酵培养液中，碳源例如可以为10g/l、12g/l、15g/l、18g/l、20g/l或该范围内的其他数值；有机氮源例如可以为10g/l、12g/l、15g/l、18g/l、20g/l或该范围内的其他数值；铵盐例如可以为5g/l、7g/l、10g/l、13g/l、15g/l或该范围内的其他数值；磷酸二氢钾例如可以为4g/l、5g/l、6g/l、7g/l、8g/l或该范围内的其他数值；磷酸氢二钾例如可以为2g/l、3g/l、4g/l、5g/l或该范围内的其他数值；硫酸镁例如可以为0.5g/l、0.6g/l、0.7g/l、0.8g/l、0.9g/l、1g/l或该范围内的其他数值；硫酸锰例如可以为0.01g/l、0.02g/l、0.03g/l、0.04g/l、0.05g/l或该范围内的其他数值；ph例如可以为6.5、6.7、7、7.3、7.5或该范围内的其他数值。
4、进一步地，本发明提供的发酵培养液中的碳源可以根据实际使用需要，选择现有技术中常规的碳源，例如可以为甘油或者玉米淀粉；有机氮源也可以根据实际使用需要，选择现有技术中常规的氮源，例如可以为酵母浸粉、蛋白胨、豆粕或者玉米浆。
5、本发明中，发明人研究发现，在微生物工业发酵过程中，首先利用碱性蛋白酶对噬菌体蛋白外壳的强降解作用对发酵环境进行消杀处理，保证了发酵罐的外部环境和空气系统无噬菌体残留，从外部减少噬菌体污染；然后使用大量铵盐替换发酵培养液中的部分有机氮源，能从内部减少噬菌体污染，并且提高发酵稳定性和发酵产物的产量，通过内外结合的方式，显著减少微生物工业发酵过程中噬菌体的污染，提高发酵的成功率。
6、具体地，本发明提供的发酵培养液中的铵盐具有如下作用：1）铵盐能阻止噬菌体吸附和侵入微生物中；2）竞争抑制：铵盐作为一种有效的氮源和/或磷源，能够促进微生物的生长和繁殖，有助于竞争性抑制噬菌体；3）优化发酵环境：铵盐可以调节培养基的ph值，保持在适宜的范围（通常是6.5-7.5），而适宜的ph值有助于优化微生物的生长条件，同时也对噬菌体的稳定性和感染能力产生负面影响；4）增加培养基的稳定性：铵盐能提高培养基的稳定性和均匀性，减少培养基成分的沉淀和不均匀分布，这种稳定性有助于减少噬菌体在培养基中形成的聚集，从而降低其对微生物的感染机会；5）支持微生物代谢：铵盐能够增强微生物的代谢能力，提高其对外界压力的抵抗能力，当微生物的代谢活动增强时，它们对噬菌体的抵抗能力也会提升，进一步减少噬菌体的侵染效应。
7、在一些实施方案中，在得到干净的发酵环境的过程中，碱性蛋白酶溶液的浓度为0.05-1mg/ml，例如可以为0.05mg/ml、0.06mg/ml、0.07mg/ml、0.08mg/ml、0.09mg/ml、1mg/ml或该范围内的其他数值；对发酵环境进行消杀处理步骤包括：对发酵外部环境进行消杀处理和对发酵内部环境进行消杀处理。
8、在一些实施方案中，对发酵外部环境进行消杀处理步骤具体包括：将碱性蛋白酶溶液喷洒于发酵车间的地面、墙面以及发酵罐、空气管道的表面，然后使用甲醛熏蒸，最后使用无菌水进行冲洗。
9、本发明中，喷洒碱性蛋白酶溶液后的作用时间可以根据实际使用需要进行常规调整，例如可以为5-6h；并且甲醛熏蒸可以杀灭空气中的噬菌体，创造一个无噬菌体的发酵操作空间，使用无菌水将处理后的碱性蛋白酶溶液冲洗干净，能防止碱性蛋白酶对后续发酵产生影响。
10、在一些实施方案中，对发酵内部环境进行消杀处理步骤具体包括：将碱性蛋白酶溶液喷洒于空气滤芯的表面，然后使用蒸汽对空气滤芯（包括空气粗滤芯和空气精滤芯）和空气管道进行灭菌处理。
11、本发明中，喷洒碱性蛋白酶溶液于空气滤芯的表面的作用时间可以根据实际使用需要进行常规调整，例如可以为4-6h；灭菌处理的时间可以根据实际使用需要进行常规调整，例如可以为4-5h；使用蒸汽灭菌以彻底失活空气滤芯表面上的碱性蛋白酶，以防治残留的碱性蛋白酶进入发酵罐中对微生物产生影响。
12、在一些实施方案中，在初始发酵液的制备过程中，发酵培养液中的铵盐选自磷酸二氢铵、氯化铵和硫酸铵中的至少一种。
13、在一些实施方案中，在初始发酵液的制备过程中，种子培养液的接种量为5-10%（v/v），例如可以为5%、6%、7%、8%、9%、10%或该范围内的其他数值；并且种子培养液包括大肠杆菌种子培养液和/或枯草芽孢杆菌种子培养液。
14、在一些实施方案中，在初始发酵液的制备过程中，发酵培养步骤具体包括：在通气量为0.5-1.0vvm（例如可以为0.5vvm、0.6vvm、0.7vvm、0.8vvm、0.9vvm、1vvm或该范围内的其他数值）、转速为150-250rpm（例如可以为150rpm、170rpm、200rpm、230rpm、250rpm或该范围内的其他数值）、温度为30-37℃（例如可以为30℃、32℃、34℃、37℃或该范围内的其他数值）的条件下进行发酵培养；初始发酵液中菌体的od600值15-20，例如可以为15、16、17、18、19、20或该范围内的其他数值。
15、在一些实施方案中，在发酵产物的制备过程中，补料培养液包括碳源150-400g/l、有机氮源30-100g/l和铵盐30-100g/l，补料时间为10-15h；其中，铵盐选自磷酸二氢铵、氯化铵和硫酸铵中的至少一种。
16、本发明提供的补料培养液中，碳源例如可以为150g/l、200g/l、250g/l、300g/l、350g/l、400g/l或该范围内的其他数值；有机氮源例如可以为30g/l、40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、80g/l、90g/l、100g/l或该范围内的其他数值；铵盐例如可以为30g/l、40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、80g/l、90g/l、100g/l或该范围内的其他数值，补料时间例如可以为10h、11h、12h、13h、14h、15h或该范围内的其他数值。
17、本发明提供的补料培养液中的碳源可以根据实际使用需要，选择现有技术中常规的碳源，例如可以为甘油或者葡萄糖；有机氮源也可以根据实际使用需要，选择现有技术中常规的氮源，例如可以为蛋白胨或者鱼蛋白胨。
18、本发明中，发明人进一步研究发现，当在补料培养液中添加铵盐时，能进一步减少噬菌体污染。
19、在一些实施方案中，在发酵产物的制备过程中，在继续进行发酵培养步骤后，还包括加入诱导剂进行诱导培养，得到发酵产物的步骤；诱导培养步骤具体包括：当发酵液中菌体的od600值为30-35（例如可以为30、31、32、33、34、35或该范围内的其他数值）时，加入0.3-0.8mm（例如可以为0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm或该范围内的其他数值）诱导剂，在温度为20-30℃（例如可以为20℃、22℃、25℃、28℃、30℃或该范围内的其他数值）的条件下，诱导培养8-20h，例如可以为8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h或该范围内的其他数值。
20、本发明中，诱导剂可以选用现有技术中常规的诱导剂，例如可以选择常用的iptg；并且诱导时间和温度可以根据发酵产物的特性进行常规调整。
21、在一些实施方案中，还包括将发酵过程中产生的尾气通入尾气罐中进行处理的步骤；其中，尾气罐中含有碱性溶液。
22、在一些优选的实施方案中，碱性溶液的浓度为0.5-1m，并且碱性溶液选自氢氧化钠和氢氧化钾中的至少一种。
23、本发明的有益效果是：区别于现有技术的情况，本发明提供的防止方法中，首先利用碱性蛋白酶对噬菌体蛋白外壳的强降解作用对发酵环境进行消杀处理，保证了发酵罐的外部环境和空气系统无噬菌体残留，从外部减少噬菌体污染；然后使用大量铵盐替换发酵培养液中的部分有机氮源，能从内部减少噬菌体污染，并且提高发酵稳定性和发酵产物的产量，通过内外结合的方式，显著减少微生物工业发酵过程中噬菌体的污染，提高发酵的成功率。因此，该防治方法在微生物工业发酵中具有较好的应用前景。
1.一种针对微生物工业发酵中噬菌体污染的防治方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的防治方法，其特征在于，在得到所述干净的发酵环境的过程中，所述碱性蛋白酶溶液的浓度为0.05-1mg/ml，对所述发酵环境进行消杀处理步骤包括：对发酵外部环境进行消杀处理和对发酵内部环境进行消杀处理。
3.根据权利要求2所述的防治方法，其特征在于，对所述发酵外部环境进行消杀处理步骤具体包括：将所述碱性蛋白酶溶液喷洒于发酵车间的地面、墙面以及发酵罐、空气管道的表面，然后使用甲醛熏蒸，最后使用无菌水进行冲洗。
4.根据权利要求2所述的防治方法，其特征在于，对所述发酵内部环境进行消杀处理步骤具体包括：将所述碱性蛋白酶溶液喷洒于空气滤芯的表面，然后使用蒸汽对所述空气滤芯和空气管道进行灭菌处理。
5.根据权利要求1所述的防治方法，其特征在于，在所述初始发酵液的制备过程中，所述发酵培养液中的铵盐选自磷酸二氢铵、氯化铵和硫酸铵中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的防治方法，其特征在于，在所述初始发酵液的制备过程中，所述种子培养液的接种量为5-10%，并且所述种子培养液包括大肠杆菌种子培养液和/或枯草芽孢杆菌种子培养液。
7.根据权利要求1所述的防治方法，其特征在于，在所述初始发酵液的制备过程中，发酵培养步骤具体包括：在通气量为0.5-1.0vvm、转速为150-250rpm、温度为30-37℃的条件下进行发酵培养；所述初始发酵液中菌体的od600值15-20。
8.根据权利要求1所述的防治方法，其特征在于，在所述发酵产物的制备过程中，所述补料培养液包括碳源150-400g/l、有机氮源30-100g/l和铵盐30-100g/l，补料时间为10-15h；
9.根据权利要求1所述的防治方法，其特征在于，在所述发酵产物的制备过程中，在继续进行发酵培养步骤后，还包括加入诱导剂进行诱导培养，得到发酵产物的步骤；所述诱导培养步骤具体包括：当发酵液中菌体的od600值为30-35时，加入0.3-0.8mm诱导剂，在温度为20-30℃的条件下，诱导培养8-20h。
10.根据权利要求1所述的防治方法，其特征在于，还包括将发酵过程中产生的尾气通入尾气罐中进行处理的步骤；
