本发明属于纳米制剂，具体涉及一种仿生纳米载药囊泡及其制备方法和应用。
背景技术：
1、光动力治疗(pdt)是一种利用特定波长的光源激活光敏剂并产生外源活性氧(reactiveoxygen species，ros)进而诱导肿瘤细胞死亡的治疗模式，光敏剂是pdt的关键元件。目前，pdt已被fda批准用于部分肿瘤的临床治疗以及症状缓解。由pdt引起的肿瘤细胞死亡可改变肿瘤的免疫原性，激活特异性抗肿瘤免疫反应，即诱导免疫原性细胞死亡icd。研究证实，光动力纳米治疗平台在通过产生ros杀伤肿瘤细胞的同时，也伴随钙网蛋白(calreticulin，crt)、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，atp)、高迁移率族蛋白b1(high mobility group box 1，hmgb1)等损伤相关分子模式(damage-associatedmolecular patterns，damps)的分泌及释放，进而调控抗原加工和递呈过程，激活特异性免疫应答，诱导icd。
2、常规的细胞质定位pdt效果会因ros半衰期短且活性半径有限而导致抗肿瘤免疫反应随之受限，加之肿瘤微环境的免疫抑制效应，使得pdt介导的t细胞免疫应答不能发挥明显的抗肿瘤效果。
3、为了强化pdt介导的抗肿瘤免疫反应，迫切需要研制一种新型pdt系统来高效地诱导细胞发生免疫原性死亡。
4、细胞膜定位的pdt可精准地将ros递送至亚细胞靶位点，有效解决ros半衰期短且活性半径小的问题，提高ros生物利用度和pdt抗肿瘤效果。
5、除此之外，膜定位pdt所介导的特异性质膜损伤可引发细胞内的内容物能快速释放，因而也促进免疫原性信号damps的有效释放，增强icd诱导。
技术实现思路
1、针对上述现有技术，本发明提供一种仿生纳米载药囊泡及其制备方法和应用，解决了二氢青蒿素(dha)溶解性差、生物半衰期短、生物利用度低以及药物递送过程中的生物学屏障等问题。
2、为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种仿生纳米载药囊泡的制备方法，包括以下步骤：
3、s1：制备具有肿瘤细胞膜锚定功能的光动力纳米材料pacp；
4、s2：制备肿瘤细胞膜碎片，然后将肿瘤细胞膜碎片与pacp共孵育，得具有肿瘤渗透/膜融合性的光敏剂修饰细胞膜囊泡pacp-m；
5、s3：将二氢青蒿素溶液与聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液混合后滴入蒸馏水中，经透析、冷冻干燥得plga-dha；然后将plga-dha与所述pacp-m混合，然后通过挤压200nm聚碳酸酯膜3～5次，即得仿生纳米载药囊泡plga-dha@pacp-m。
6、本发明的有益效果为：本发明研制出一种具备肿瘤细胞膜锚定潜质的高效光动力纳米材料pacp，并进一步与乳腺癌来源的细胞膜相互作用，形成由pacp修饰的肿瘤细胞膜囊泡，再通过与载药纳米颗粒plga-dha结合，得到一种仿生纳米载药囊泡，因天然产物衍生物dha可以抑制乳腺癌细胞增殖，而且还能够通过调控铁代谢相关蛋白、干扰铁稳态来上调细胞内源性fe2+浓度，鉴于此，构建仿生纳米载药囊泡plga-dha@pacp-m来激活内源性铁死亡信号。
7、在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
8、进一步，pacp的制备包括以下步骤：
9、s11：对甲氧基聚乙二醇进行羧基化处理，得到羧基化的甲氧基聚乙二醇mpeg-cooh；
10、s12：对硫酸软骨素进行乙酰化处理，得到乙酰化硫酸软骨素ac-cs；
11、s13：将mpeg-cooh、nhs和edc按35～45:15～25:10～20的质量比混合，再将混合物按70～80mg:60ml的料液比分散于有机溶剂中，于室温下反应2～3h，得溶液一；将ac-cs和dmap按4:1的质量比混合，再将混合物按100mg:70～80ml的料液比分散于有机溶剂中，得溶液二；将ppix、nhs和edc按15～20:70～80:55～60的质量比混合，再将混合物按145～150mg:30ml的料液比分散于有机溶剂中，于室温下反应3～4h，得溶液三；
12、s14：将溶液一和溶液二按6～7:7～8体积比混合，于室温下反应10～15h；然后将溶液三加入到反应后的体系中，继续于室温下避光反应45～50h，即得；所加入的溶液三与溶液一的体积之比为1:2～3。
13、采用进一步技术方案的有益效果是：合成并制备了一种具有潜在的肿瘤细胞质膜锚定功能的光动力纳米材料pacp，相较于游离的小分子ppix，pacp高分子在体积庞大的亲水peg链的辅助下具有更强的构象灵活性，使其具有优越的膜锚定亲和性；并且，由于亲水性peg片段的空间位阻，使pacp具有抵抗细胞摄取的能力，因此带来良好的膜锚定效应，而亲脂性的ppix分子可以嵌插在质膜的磷脂双分子层上，ac-cs与胞膜cd44受体间存在靶向亲和力，三者共同作用可增强pacp分子与质膜的结合能力。
14、进一步肿瘤细胞膜碎片的制备包括以下步骤：
15、s21：培养肿瘤细胞；
16、s22：收集培养的肿瘤细胞，将肿瘤细胞置于低渗缓冲液中，然后在冰浴下超声破碎肿瘤细胞3～5次，将破碎后的肿瘤细胞以500g离心力离心4min，取上清液以10000g离心力离心10min，继续取上清液以100000g离心力离心1h，即得。
17、进一步，肿瘤细胞为鼠源乳腺癌细胞4t1。
18、进一步，肿瘤细胞膜碎片与pacp共孵育的条件为：25℃室温条件下，以350～450rpm转速搅拌30min～1h。
19、进一步，肿瘤细胞膜碎片与pacp共孵育后依次挤出通过400nm和200nm孔径的聚碳酸酯膜，得pacp-m。
20、采用进一步技术方案的有益效果是：相较于传统光动力纳米治疗平台，pacp-m兼具肿瘤渗透性和膜融合性，增加ros原位产生及其生物利用度，深度穿透肿瘤，达到同时消除表层和深层肿瘤的效果，高效诱导肿瘤细胞icd，是一种实现更精确、更高效pdt疗法的新策略。
21、进一步，二氢青蒿素溶液的溶剂为二甲基亚砜，其浓度为10～20mg/ml；聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液的溶剂为丙酮，其浓度为1～2mg/ml；二氢青蒿素溶液与聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液的体积比为1:50。
22、进一步plga-dha与所述pacp-m的质量比为2～3：1。
23、本发明还公开了仿生纳米载药囊泡的制备方法制得的仿生纳米载药囊泡。
24、本发明还公开了仿生纳米载药囊泡在制备治疗肿瘤的产品中的应用。
25、本发明的有益效果是：仿生纳米载药囊泡plga-dha@pacp-m既是精准的光敏剂，又是高效的药物载体，可同时触发膜融合光动力效应和内源性铁死亡，促进免疫原性细胞死亡，改善乳腺癌免疫原性，提高t细胞肿瘤浸润，为icis联合治疗提供新的选择。有望提高药物递送效率和增强免疫检查点抑制剂疗效，有助于纳米药物用于临床肿瘤治疗的转化应用。
1.一种仿生纳米载药囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的仿生纳米载药囊泡的制备方法，其特征在于，所述pacp的制备包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的仿生纳米载药囊泡的制备方法，其特征在于，所述肿瘤细胞膜碎片的制备包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的仿生纳米载药囊泡的制备方法，其特征在于：所述肿瘤细胞为鼠源乳腺癌细胞4t1。
5.根据权利要求1所述的仿生纳米载药囊泡的制备方法，其特征在于，肿瘤细胞膜碎片与pacp共孵育的条件为：25℃室温条件下，以350～450rpm转速低速搅拌30min～1h。
6.根据权利要求5所述的仿生纳米载药囊泡的制备方法，其特征在于，肿瘤细胞膜碎片与pacp共孵育后依次挤出通过400nm和200nm孔径的聚碳酸酯膜，得pacp-m。
7.根据权利要求1所述的仿生纳米载药囊泡的制备方法，其特征在于，所述二氢青蒿素溶液的溶剂为二甲基亚砜，其浓度为10～20mg/ml；所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液的溶剂为丙酮，其浓度为1～2mg/ml；所述二氢青蒿素溶液与聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液的体积比为1：50。
8.根据权利要求1所述的仿生纳米载药囊泡的制备方法，其特征在于：所述plga-dha与所述pacp-m的质量比为2～3:1。
9.权利要求1～8任一项所述的仿生纳米载药囊泡的制备方法制得的仿生纳米载药囊泡。
10.权利要求9所述的仿生纳米载药囊泡在制备治疗肿瘤的产品中的应用。
