本发明涉及药物分析，具体涉及一种冬虫夏草粉末的鉴别方法。
背景技术：
1、冬虫夏草粉末是麦角菌科真菌冬虫夏草菌cordyceps sinensis(berk.)sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上形成的子座及幼虫尸体的复合体的冬虫夏草经粉碎后的粉末，是我国传统名贵滋补中药材，在医疗保健领域具有较高的应用价值。冬虫夏草真菌具有专一寄生属性并需要特殊的生存环境，国内研究者通过分离天然虫草菌株进行深层发酵得到发酵虫草菌粉，其主要化合物的种类与冬虫夏草基本相同，但各化合物含量有所差异，这也导致其药效价值与冬虫夏草存在一定的差异，并且由于冬虫夏草价格昂贵，而发酵虫草菌粉生产成本低，资源丰富，价格低廉，并且粉末形态上与冬虫夏草粉末极其相似，肉眼不易辨别，若进行鉴别，存在需要较为昂贵的设备、试剂，成本高，操作复杂，难度大，鉴别所需时间长，或者需要熟练的操作和丰富的鉴别经验等问题。
2、因此，为了防止不法商家使用发酵虫草菌粉来冒充冬虫夏草粉末，有必要建立一种快速、有效、便捷、低成本的方法对冬虫夏草粉末进行鉴别。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案。
2、本发明提供一种鉴别冬虫夏草粉末的方法，其包括：
3、(1)供试品溶液1制备：将供试品粉末与含腺苷的缓冲液混合，放置一定时间后，然后高温处理，放冷至室温，过滤，取续滤液，得到供试品溶液1；
4、(2)供试品溶液2的制备：将供试品粉末与缓冲液混合，放置一定时间后，然后高温处理，放冷至室温，过滤，取续滤液，得到供试品溶液2；
5、(3)对照品溶液的制备：用水溶解肌苷对照品，得到对照品溶液；
6、(4)肌苷检测：分别检测供试品溶液1、供试品溶液2和对照品溶液中的肌苷含量，计算供试品溶液1相比供试品溶液2的肌苷增加量；
7、(5)判定：根据供试品溶液1相比供试品溶液2的肌苷增加量判定供试品粉末是否为冬虫夏草粉末。
8、在一些实施例中，所述步骤(1)中的含腺苷的缓冲液的ph为4-10，所述步骤(2)的缓冲液的ph与所述步骤(1)中的含腺苷的缓冲液的ph相同。在一些实施例中，所述步骤(1)中的含腺苷的缓冲液的ph为4、5、6、7、8、9或10，所述步骤(2)的缓冲液的ph与所述步骤(1)中的含腺苷的缓冲液的ph相同。
9、在一些实施例中，所述含腺苷的缓冲液的制备方法包括：用所述缓冲液溶解腺苷，得到所述含腺苷的缓冲液。
10、在一些实施例中，所述步骤(2)的缓冲液和所述步骤(1)中的含腺苷的缓冲液的缓冲液为tris-马来酸缓冲液。
11、在一些实施例中，所述步骤(1)中的含腺苷的缓冲液的腺苷的浓度为0.5μmol/l-20μmol/l。在一些实施例中，所述步骤(1)中的含腺苷的缓冲液的腺苷的浓度为0.5μmol/l、1μmol/l、2μmol/l、3μmol/l、4μmol/l、5μmol/l、6μmol/l、7μmol/l、8μmol/l、9μmol/l、10μmol/l、11μmol/l、12μmol/l、13μmol/l、14μmol/l、15μmol/l、16μmol/l、17μmol/l、18μmol/l、19μmol/l或20μmol/l。在一些实施例中，所述步骤(1)中的含腺苷的缓冲液的腺苷的浓度为2μmol/l。
12、在一些实施例中，所述步骤(1)中，所述供试品粉末与含腺苷的缓冲液混合后于20℃-65℃放置一定时间后，然后高温处理，放冷至室温，过滤，取续滤液，得到供试品溶液1。在一些实施例中，所述步骤(1)中，所述供试品粉末与含腺苷的缓冲液混合后于20℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或65℃放置一定时间后，然后高温处理，放冷至室温，过滤，取续滤液，得到供试品溶液1。
13、在一些实施例中，所述步骤(2)中，所述供试品粉末与缓冲液混合后于20℃-65℃放置一定时间后，然后高温处理，放冷至室温，过滤，取续滤液，得到供试品溶液2；其中所述步骤(2)中所述放置的温度与所述步骤(1)中所述放置的温度相同。在一些实施例中，所述步骤(2)中，所述供试品粉末与缓冲液混合后于20℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或65℃放置一定时间后，然后高温处理，放冷至室温，过滤，取续滤液，得到供试品溶液2；其中所述步骤(2)中所述放置的温度与所述步骤(1)中所述放置的温度相同。
14、在一些实施例中，所述步骤(1)中的一定时间为至少10min，所述步骤(2)中的一定时间与所述步骤(1)中的一定时间相同。在一些实施例中，所述步骤(1)中的一定时间为10min-120min，所述步骤(2)中的一定时间与所述步骤(1)中的一定时间相同。在一些实施例中，所述步骤(1)中的一定时间为10min、20min、30min、35min、40min、50min、60min、70min、80min、90min、100min、110min或120min，所述步骤(2)中的一定时间与所述步骤(1)中的一定时间相同。
15、在一些实施例中，所述步骤(1)中所述供试品粉末的重量与所述含腺苷的缓冲液的体积的比值为5mg/ml-200mg/ml；所述步骤(2)中所述供试品粉末的重量与缓冲液的体积的比值与所述步骤(1)中所述供试品粉末的重量与所述含腺苷的缓冲液的体积的比值相同。在一些实施例中，所述步骤(1)中所述供试品粉末的重量与所述含腺苷的缓冲液的体积的比值为5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、110mg/ml、120mg/ml、130mg/ml、140mg/ml、150mg/ml、160mg/ml、170mg/ml、180mg/ml、190mg/ml或200mg/ml；所述步骤(2)中所述供试品粉末的重量与缓冲液的体积的比值与所述步骤(1)中所述供试品粉末的重量与所述含腺苷的缓冲液的体积的比值相同。
16、在一些实施例中，所述步骤(3)中所得对照品溶液中的肌苷浓度为0.1mol/ml-2.5μmol/ml。在一些实施例中，所述步骤(3)中所得对照品溶液中的肌苷浓度为0.2μmol/ml-1.0μmol/ml。在一些实施例中，所述步骤(3)中所得对照品溶液中的肌苷浓度为0.1μmol/ml、0.2μmol/ml、0.3μmol/ml、0.4μmol/ml、0.5μmol/ml、1.0μmol/ml、1.5μmol/ml、2.0μmol/ml或2.5μmol/ml。
17、在一些实施例中，所述高温处理为于90℃-100℃处理。在一些实施例中，所述高温处理为于90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃处理。
18、在一些实施例中，所述高温处理的时间为5min-15min。在一些实施例中，所述高温处理的时间为5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min或15min。
19、在一些实施例中，所述步骤(5)的判定为：
20、相比供试品溶液2，供试品溶液1中肌苷的增加量大于0.05μmol/100mg粉末的供试品为冬虫夏草粉末；
21、相比供试品溶液2，供试品溶液1中肌苷的增加量小于或等于0.05μmol/100mg粉末的供试品为非冬虫夏草粉末。
22、在一些实施例中，所述冬虫夏草粉末为含冬虫夏草虫体的冬虫夏草粉末。
23、在一些实施例中，所述步骤(4)采用高效液相色谱法进行肌苷检测。
24、在一些实施例中，所述高效液相色谱法的色谱柱为亲水性十八烷基硅烷键合硅胶。
25、在一些实施例中，所述高效液相色谱法的流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为缓冲盐水溶液，所述流动相b为流动相a与甲醇的体积比为85:15-90:10或为90:10的混合液；所述高效液相色谱法的洗脱方式为梯度洗脱。
26、在一些实施例中，所述高效液相色谱法的色谱柱为agilent polaris c18-a色谱柱或其等效色谱柱。
27、在一些实施例中，所述梯度洗脱为：
28、
29、
30、在一些实施例中，所述缓冲盐水溶液的ph为5.3-6.3。在一些实施例中，所述缓冲盐水溶液的ph为5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2或6.3。
31、在一些实施例中，所述缓冲盐水溶液为磷酸盐缓冲液。
32、在一些实施例中，所述缓冲盐水溶液中的缓冲盐为磷酸氢二钾和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠中的至少一种。
33、在一些实施例中，所述缓冲盐水溶液中缓冲盐的浓度为0.01mol/l-0.10mol/l或为0.05mol/l。
34、在一些实施例中，所述缓冲盐水溶液的制备方法包括：用0.05mol/l的磷酸氢二钾水溶液调节0.05mol/l的磷酸二氢钾水溶液至ph为5.3-6.3。
35、在一些实施例中，所述高效液相色谱法的检测波长为255nm-265nm。在一些实施例中，所述高效液相色谱法的检测波长为255nm、256nm、257nm、258nm、259nm、260nm、261nm、262nm、263nm、264nm或265nm。
36、在一些实施例中，所述高效液相色谱法的流速为0.5ml/min-0.7ml/min。在一些实施例中，所述高效液相色谱法的流速为0.6ml/min。
37、在一些实施例中，所述高效液相色谱法的柱温为20℃-30℃。在一些实施例中，所述高效液相色谱法的柱温为20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃
38、在一些实施例中所述流动相b为流动相a与甲醇的体积比为85:15、86:14、87:13、88:12、89:11或90:10的混合液。在一些实施例中，所述流动相b为流动相a与甲醇的体积比为90:10的混合液。
39、在一些实施例中，所述色谱柱的内径为2.0mm-4.6mm。在一些实施例中，所述色谱柱的内径为2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm、4.5mm或4.6mm。在一些实施例中，所述色谱柱的内径为4.6mm。
40、在一些实施例中，所述色谱柱的柱长为100mm-250mm。在一些实施例中，所述色谱柱的柱长为100mm、150mm、200mm或250mm。在一些实施例中，所述色谱柱的柱长为150mm。
41、在一些实施例中，所述色谱柱的填料粒径为1.7μm-5μm。在一些实施例中，所述色谱柱的填料粒径为1.7μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm或5μm。
42、在一些实施例中，所述色谱柱的内径为4.6mm，柱长为150mm，填料粒径为5μm。
43、有益效果
44、相比现有技术，本发明具有以下有益效果：
45、本发明所提供的鉴别方法设备简单，成本低，难度小，准确性高，速度快，可快速、有效、简便、低成本地鉴别供试品粉末是否为冬虫夏草粉末。
46、术语说明
47、在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
48、术语“室温”表示环境温度，指温度在大约10℃至大约30℃，或大约20℃至30℃，或大约25℃。
49、在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
50、术语“v/v”表示体积比。
51、术语“％vol”表示体积百分比。
52、在下面的内容中，无论是否使用“大约”或“约”等字眼，所有在此公开了的数字均为近似值。每一个数字的数值有可能会出现1％、2％、5％、7％、8％、10％、15％或20％等差异。每当公开一个具有n值的数字时，任何具有n+/-1％,n+/-2％,n+/-3％,n+/-5％,n+/-7％,n+/-8％,n+/-10％,n+/-15％or n+/-20％值的数字会被明確地公开,其中“+/-”是指加或减。
1.一种鉴别冬虫夏草粉末的方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(1)中的含腺苷的缓冲液的ph为4-10，所述步骤(2)的缓冲液的ph与所述步骤(1)中的含腺苷的缓冲液的ph相同；和/或
3.根据权利要求1-2任一项所述的方法，所述步骤(1)中，所述供试品粉末与含腺苷的缓冲液混合后于20℃-65℃放置一定时间后，然后高温处理，放冷至室温，过滤，取续滤液，得到供试品溶液1；和/或
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，所述步骤(1)中的一定时间为至少10min或者为10min-120min，所述步骤(2)中的一定时间与所述步骤(1)中的一定时间相同。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，所述步骤(1)中所述供试品粉末的重量与所述含腺苷的缓冲液的体积的比值为5mg/ml-200mg/ml或为100mg/ml；所述步骤(2)中所述供试品粉末的重量与缓冲液的体积的比值与所述步骤(1)中所述供试品粉末的重量与所述含腺苷的缓冲液的体积的比值相同；和/或
6.根据权利要求1-4任一项所述的方法，所述高温处理为于90℃-100℃处理；和/或
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，所述步骤(5)的判定为：
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，所述步骤(4)采用高效液相色谱法进行肌苷检测；
9.根据权利要求8所述的方法，所述高效液相色谱法的色谱柱为agilent polarisc18-a色谱柱或其等效色谱柱；
10.根据权利要求8-9任一项所述的方法，所述色谱柱的内径为2.0mm-4.6mm或为4.6mm；和/或
