本发明涉及微生物领域，特别涉及优化弱化ilve基因表达的工程菌及发酵生产维生素b5的方法。
背景技术：
1、维生素b5(vitamin b5，vb5)又称d-泛酸(d-pantothenic acid)，是一种水溶性维生素，是辅酶a及酰基载体蛋白的组成部分，作为70多种酶的辅助因子参与糖、脂肪、蛋白质和能量代谢，具有重要的生理代谢调控作用。vb5主要用于动物饲料添加剂、食品添加剂和医药原料药，随着vb5新功能的发现和应用领域的拓展，其市场需求仍将呈现稳定增长的趋势。
2、中国是vb5生产和出口的第一大国，工业生产vb5方法为化学合成法，企业基本采用异丁醛-甲醛-氢氰酸法合成dl-泛解酸内酯，dl-泛解酸内酯进一步通过化学或酶法拆分获得l-泛解酸内酯，最后l-泛解酸内酯与以丙烯腈为原料生产的β-丙氨酸合成vb5。化学合成vb5的主要原料易燃、易爆、剧毒，生产过程中会产生含氰废水，处理难度大，导致vb5成为重污染产业。
3、环保对vb5产业的影响已经逐步显现。在大规模高强度的环保治理下，高污染的vb5企业限产甚至停产，市场供应短缺，价格暴涨，限制了下游饲料、食品和医药行业的健康发展。在高污染的vb5生产技术没有重大改进之前，这样的供需局面仍会长期持续，因此，vb5绿色制造技术的创新迫在眉睫！
4、微生物发酵法生产vb5，不仅以可再生的葡萄糖为原料，而且生产过程中形成的废渣、废水和废气易于处理和资源化利用，可有效解决vb5产业的高污染问题。微生物利用葡萄糖合成vb5的代谢途径的调控机制复杂，发酵产量极低。已报道过利用微生物发酵来生产vb5。例如，文献1
5、(cn109868254b)报道了从大肠杆菌w1330制备得到vb5工程菌的方法，及使用所述方法改造得到的工程菌株zjb18003。据报道，该菌株的vb5产量为1.54g/l，原料转化率不高。文献1还报道了该菌株不利于工业发酵生产vb5的其他缺陷，例如，其生长由于改造而受到抑制，从而不利于在发酵过程中快速增加生物量；又例如，其在合成vb5的过程中需要依赖外源添加昂贵的β-丙氨酸(2.5g/l)。
6、l-缬氨酸作为vb5生物合成的上游支路代谢途径，非常容易积累。摇瓶发酵结果显示，副产物缬氨酸的产量与vb5相当，达到10g/l以上，导致vb5转化率低，生产成本高，是限制工业化应用关键原因。然而，通过敲除ilve基因阻断缬氨酸代谢，则会同时阻断异亮氨酸和亮氨酸合成，导致三种支链氨基酸营养缺陷。发酵过程中需要额外补加支链氨基酸，同样会大大增加发酵成本，限制工业化应用。
7、因此本发明提供了一种弱化ilve基因表达的方法，使工程菌处于最小产生缬氨酸且维持正常生长不影响vb5生产的最优状态，从而减少副产物积累提高vb5转化率，降低vb5的发酵生产成本，具有重要工业应用价值。
技术实现思路
1、有鉴于此，发明人在ilve基因原始rbs序列的基础上，设计了5种不同翻译强度的rbs突变序列。rbs序列的翻译强度可通过线上软件(https://www.denovodna.com)计算(nature biotechnology，2009，27,946–950)。
2、通过基因编辑在大肠杆菌染色体上突变了ilve基因的内源rbs，同时以vb5发酵产量和缬氨酸产量为指标，筛选出缬氨酸发酵产量大幅降低且vb5产量显著提高的ilve基因rbs优化序列。
3、所述rbs优化序列包括如seq id no：64所示的核苷酸序列。在优选的实施方式中，seq id no：64所示的核苷酸序列相对于所述ilve基因而言位于起始密码子之前的-1至-17位的范围内。在更优选的实施方式中，seq id no：64所示的核苷酸序列相对于所述ilve基因而言位于起始密码子之前的-1至-16位的范围内。
4、本发明公开了ilve基因的rbs优化序列在生产维生素b5中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进ilve基因的rbs翻译活性实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现要素：
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
5、本发明的第一方面提供了一种ilve基因rbs优化序列，所述rbs优化序列包括如seq id no：64所示的核苷酸序列。
6、在一些可能的实施方式中，所述rbs优化序列具有如seq id no：8所示的核苷酸序列。
7、在一些可能的实施方式中，本发明还提供了含有所述ilve基因rbs优化序列的载体或宿主。
8、本发明还提供了所述的ilve基因rbs优化序列在制备用于生产维生素b5的工程菌中的应用。
9、本发明的另一方面还提供了包含本公开的rbs优化序列的工程菌，其特征在于，所述工程菌中的ilve基因与本公开的rbs优化序列可操作地连接。在优化的实施方式中，所述rbs优化序列包括如seq id no：64所示的核苷酸序列。在进一步优化的实施方式中，所述rbs优化序列相对于所述ilve基因而言位于起始密码子之前-1至-17位的范围内。在更进一步优选的实施方式中，所述rbs优化序列相对于所述ilve基因而言位于起始密码子之前的-1至-16位的范围内。
10、在一些可能的实施方式中，本发明提供的工程菌含有如seq id no：64或seq idno：8所示的核苷酸序列。
11、在一些可能的实施方式中，本发明中的工程菌为生产vb5的工程菌。工程菌中可含有例如包含如seq id no：7所示序列的ilve基因。在一些实施方式中，只需要使ilve基因与包含如seq id no：64所示的核苷酸序列或者如seq id no：8所示的核苷酸序列的rbs优化序列可操作地连接，即可获得本文公开的工程菌。在优选的实施方式中，本公开的工程菌在ilve基因上游包含如seq id no：64所示的核苷酸序列。在更优选的实施方式中，本公开的工程菌在ilve基因上游的rbs序列的-1至-17位的范围内包含如seq id no：64所示的核苷酸序列。在进一步优选的实施方式中，本公开的工程菌在ilve基因上游的rbs序列的-1至-16位的范围内包含如seq id no：64所示的核苷酸序列。在最优选的实施方式中，本公开的工程菌包含与ilve基因可操作连接的如seq id no：8所示的核苷酸序列。在一些可能的实施方式中，得到的工程菌中含有如seq id no：43所示的核苷酸序列。
12、一些可能的实施方式中，本公开的工程菌还具有如下特征：(1)表达来源于大肠杆菌bl21的ilvg+m基因；和/或
13、(2)表达来源于地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)的l-天冬氨酸α-脱羧酶基因pand；
14、作为优选，所述来源于地衣芽孢杆菌的l-天冬氨酸α-脱羧酶基因pand具有：
15、(a)如seq id no：1所示的核苷酸序列；或
16、(b)如(a)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(a)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
17、(c)与(a)或(b)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；和/或
18、(3)增加的panb、panc和/或pane基因的拷贝数，优选增加1～20个拷贝。
19、在一些可能的实施方式中，所述质粒含有panb、panc和pane基因中的任一种或多种，panb、panc和pane基因可以分别与相同或不同的启动子可操作地连接。在一些可能的实施方式中，所述启动子为pj23119启动子和/或trc启动子。在一些可能的实施方式中，所述质粒含有panb、panc和pane基因，panb和panc基因为panbc且与trc启动子可操作地连接，pane基因与pj23119启动子可操作地连接。在一些可能的实施方式中，本公开的工程菌包括含有panb、panc和/或pane基因中的任一种或多种的质粒。在一些可能的实施方式中，panb基因编码酮泛解酸羟甲基转移酶，催化底物a-酮异戊酸增加一个甲基形成酮泛解酸，panb基因的非限制性的示例包括如seq id no：68所示的核苷酸序列。在一些可能的实施方式中，pane基因编码酮泛解酸还原酶，将酮泛解酸还原为泛解酸，pane基因的非限制性的示例包括如seq id no：70所示的核苷酸序列。在一些可能的实施方式中，panc基因编码泛酸合成酶，进一步催化泛解酸和β-丙氨酸缩合形成vb5，panc基因的非限制性的示例包括如seqid no：69所示的核苷酸序列。在一些可能的实施方式中，panb、panc和/或pane基因的拷贝数增加2-5个或3-8个或6-18个或7-15个。
20、在本发明的一些具体实施方案中，所述工程菌还包括与强启动子和/或强rbs可操作地连接的ilvg+m和pand基因。在优选的实施方式中，所述强启动子为pl启动子和/或trc启动子，所述强rbs为bcd2。在更优选的实施方式中，所述bcd2具有：
21、(a)如seq id no：2所示的核苷酸序列；或
22、(b)如(a)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(a)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
23、(c)与(a)或(b)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列。
24、在一些可能的实施方式中，所述ilvg+m和pand基因均与trc启动子或/或pl启动子可操作地连接。在一些可能的实施方式中，所述ilvg+m基因与trc启动子，pand基因与pl启动子可操作地连接。在一些可能的实施方式中，所述ilvg+m基因与pl启动子，pand基因与trc启动子可操作地连接。在一些可能的实施方式中，pl启动子包括如seq id no：37所示的核苷酸序列。在一些可能的实施方式中，trc启动子包括如seq id no：39所示的核苷酸序列。
25、在优选的实施方式中，本公开的工程菌源自大肠杆菌，优选大肠杆菌k12，更优选大肠杆菌k12 mg1655株。
26、本发明还提供了本公开的工程菌在生产维生素b5中的应用。在一些实施方式中，维生素b5还包括维生素b5的衍生物，如泛醇。
27、本发明还提供了生产维生素b5的方法，其特征在于，以本公开的工程菌为发酵菌株，发酵制备维生素b5。
28、与高污染的化学法生产维生素b5相比，本发明生物法生产维生素b5，具有原料可再生，废渣、废水和废气易于处理和资源化利用等优点，从而在实践上可用于维生素b5的工业化生产，具有重要的应用价值。
29、本发明所用的大肠杆菌为k12 mg1655株，其ilvg基因突变失活。因此本发明引入了大肠杆菌bl21的具有活性的ilvg+m基因，提高了vb5的前体乙酰乳酸合成供应。本发明在大肠杆菌k12 mg1655的染色体上插入了来源于大肠杆菌bl21的ilvg+m基因，且使用trc强启动子调控ilvg+m的转录起始，使用终止子ter调控ilvg+m的转录终止。ilvg+m基因在染色体的插入位点为avta基因的编码序列，导致avta失活，弱化了缬氨酸的合成，从而弱化了vb5的竞争途径，有利于vb5的生物合成。
30、在工程菌avta基因上还整合了源于地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)的pand基因。使用强启动子pl和bcd2分别调控转录和翻译起始。
31、发酵生产vb5的方法，培养基包含碳源、氮源、无机离子、抗生素和其它的营养因子。作为碳源，可以使用葡萄糖、乳糖、半乳糖等糖类。作为无机氮源，可以使用氨水、硫酸铵、磷酸铵、氯化铵等无机氮源；作为有机氮源可以使用玉米浆、豆粕水解液、毛发粉、酵母提取物、蛋白胨等有机氮源。无机离子包含铁、钙、镁、锰、钼、钴、铜、钾等离子中的一种或多种。培养基无需额外添加β-丙氨酸。
1.一种ilve基因rbs优化序列，其特征在于，所述rbs优化序列包括如seq id no：64所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的ilve基因rbs优化序列在制备用于生产维生素b5的工程菌中的应用。
3.一种工程菌，其特征在于，所述工程菌中的ilve基因与包括如seq idno：64所示的核苷酸序列的rbs优化序列可操作地连接，所述rbs优化序列位于所述ilve基因的起始密码子之前，优选相对于所述ilve基因而言位于起始密码子之前-1至-17位的范围内。
4.如权利要求3所述的工程菌，其还表达来源于大肠杆菌bl21的ilvg+m基因；和/或
5.如权利要求3或4所述的工程菌，其源自大肠杆菌，优选大肠杆菌k12，更优选大肠杆菌k12 mg1655株。
6.如权利要求3-5中任一项所述的工程菌在生产维生素b5中的应用。
7.生产维生素b5的方法，其特征在于，以权利要求3-5中任一项所述的工程菌为发酵菌株，发酵制备维生素b5。
