本发明属于食品安全检测，具体涉及一种铅离子(pb2+)检测方法及试剂盒。
背景技术：
1、铅是一种常见的重金属元素，铅离子(pb2+)在环境中分布广泛且具有高生物毒性，即使微量pb2+也会因生物富集效应而最终引起人体严重的健康问题。食品中的铅离子通常来自于多种渠道，包括土壤、水源、工业污染、农药、食品加工过程中的污染以及食品包装材料中的铅含量。很多国家都制定了相关法律来规范水及食品中pb2+的含量。水和食品中的离子对人体健康具有严重影响。长期摄入过量的铅可能导致多种健康问题，包括神经系统损伤、智力发育障碍、贫血、肾脏损伤以及生殖系统问题。尤其是对于儿童和孕妇来说，铅的摄入可能对智力和行为发育造成长期影响。因此，对pb2+所污染的水及食品进行筛查，对于保障食品安全和人体健康、维护消费者权益具有重要的意义，而这有赖于发展有效、可靠的检测方法。
2、目前，包括原子吸收光谱法(aas)、原子荧光光谱法(afs)、电感耦合等离子质谱法(icp-ms)、电感耦合等离子原子发射光谱法(icp-aes)、双硫腙分光光度法等广泛应用于pb2+的检测，这些传统检测方法具有能同时检测多种不同元素、分析时间短等优势，但由于设备仪器昂贵、运行成本高、待测物质的前处理复杂且需要经专业培训过的技术人员等缺陷，传统的检测方法在现场检测方面的应用受到了限制，且难以用于现场检测水及食品中的pb2+，因此开发具有操作简单、成本低、稳定性强的pb2+检测方法仍然具有十分重要的意义。
技术实现思路
1、本发明目的在于提供一种pb2+的高灵敏度检测方法。为最大限度的提高检测灵敏度，本发明设计了一种基于双价gr-5dnazymes介导的比色传感分析方法，结合edc和y型探针自组装级联放大反应，以实现pb2+的高灵敏检测。如图一所示，pd的序列由gr-5dnazymes区域和回文序列区域组成；该回文序列可通过碱基互补配对自发形成双链结构，使得pd经退火处理后自动生成双价gr-5dnazymes(2pd)。当体系中不含有pb2+时，2pd不能裂解h1，使后续的级联放大反应无法进行。当体系中含有pb2+时，2pd因与pb2+相互作用而被激活，进而催化h1的ra位点磷酸二酯键的断裂，同时释放出2条引发链t，进一步启动edc循环；t首先与三链复合物e1-e2-e3的脚趾区域结合，引发链置换反应，逐步将e2替换出来，同时生成新的三链复合物e1-t-e3；随后，e4与e1-t-e3复合物新暴露出的脚趾区域碱基互补配对，进一步将e1和t链置换出来，同时产生新的双链复合物f-e3；被替换出来的t继续启动下一轮edc反应，e1和e2分别启动下一级的ysa反应。e1和e2均含有完整的能触发ysa反应的引发链片段，均可与h2的茎部杂交结合进而打开h2；随后，h3、h4也相继被打开，最终形成y型探针，被替换出来的e1、e2分别进入下一轮自组装反应；由于设计的h2、h3、h4均含有g4序列，形成的y型探针带有三个g4序列黏性末端，在hemin和k+作用下，折叠形成三价hemin/g四链体dnazymes，催化单组分tmb的氧化反应，使反应溶液由无色转变为蓝色，经h2so4终止反应后，溶液颜色最终呈现黄色状态。该溶液体系使用紫外可见分光光度计检测在450nm处的比色信号响应强度随着pb2+浓度的增大而变强，因此，可以实现对pb2+的痕量检测随着pb2+浓度的增加，pd催化裂解h1的速率增大，快速生成引发链t，进而激活后续的edc循环和y型探针自组装循环反应，产生大量的y型g四链体dnazymes，提升其催化活性，从而达到更大的信号放大效果，最终实现体系比色信号的增强。
2、上述的pd、发夹探针h1、三链复合物e1-e2-e3、f、发夹探针h2、h3、h4，均溶解于20mm的tris-hcl缓冲溶液(20mm三羟甲基氨基甲烷、120mm nacl、20mm kcl、10mm mgcl2、调节溶液ph值7.4)；上述的氯化血红素(hemin)溶于25mm hepes缓冲溶液(25mm 4-(2-羟乙基)-1哌嗪乙磺酸、200mm nacl、20mm kcl、0.05％triton x-100、1％dmso，ph＝7.4)。
3、上述的e1、e2、e3具有部分相同的碱基序列，h2、h3、h4、具有部分相同的碱基序列，富g序列h2链设计一段富含鸟嘌呤序列；所述的pd、e1、e2、e3、f、h2、h3、h4、的序列为表一seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seqid no.7、seq id no.8所示的序列，所述的富g序列h2链为表一seq id no.6所示的序列。
4、上述的检测方法，优选的，所述的pd浓度20、40、80、100nm；进一步优选的所述pd浓度为40nm。
5、上述的检测方法，优选的，所述的发夹探针h1浓度20、40、60、80、100nm；进一步优选的所述h1浓度为60nm。
6、上述的检测方法，优选的，所述的三链复合物e1-e2-e3浓度30、40、50、60、70nm；进一步优选的所述三链复合物e1-e2-e3浓度为50nm。
7、上述的检测方法，优选的，所述的探针f浓度30、40、50、60、70nm；进一步优选的所述f浓度为100nm。
8、上述的检测方法，优选的，所述的发夹探针h2浓度50、100、150、200、250nm；进一步优选的所述h2浓度为150nm。
9、上述的检测方法，优选的，所述的发夹探针h3浓度50、100、150、200、250nm；进一步优选的所述h3浓度为150nm。
10、上述的检测方法，优选的，所述的发夹探针h4浓度50、100、150、200、250nm；进一步优选的所述h4浓度为150nm。
11、上述的检测方法，优选的，所述hemin浓度为200、400、600、1000nm；进一步优选的所述hemin浓度为600nm。
12、上述的检测方法，优选的，所述反应时间为20、40、60、80、100min；进一步优选的反应时间为60min。
13、上述的检测方法，优选的，所述反应温度为4、25、37、45℃；进一步优选的反应温度为37℃。
14、作为同一技术构思，本发明还提供了一种pb2+检测试剂盒。所述试剂盒包括上述检测方法中所述核酸序列和试剂。
15、上述的检测试剂盒包括第一容器，所述第一容器包含所述pd，使用前用tris-hcl缓冲溶液稀释成浓度为2μm。
16、上述的检测试剂盒包括第二容器，所述第二容器包含所述发夹探针h1，使用前用tris-hcl缓冲溶液稀释成浓度为2μm。
17、上述的检测试剂盒包括第三容器，所述第三容器包含所述三链复合物e1-e2-e3，使用前用tris-hcl缓冲溶液稀释成浓度为10μm。
18、上述的检测试剂盒包括第四容器，所述第四容器包含所述发夹探针f,使用前用tris-hcl缓冲溶液稀释成浓度为10μm。
19、上述的检测试剂盒包括第五容器，所述第五容器包含所述发夹探针h2，使用前用tris-hcl缓冲溶液稀释成浓度为10μm。
20、上述的检测试剂盒包括第六容器，所述第六容器包含所述发夹探针h3，使用前用tris-hcl缓冲溶液稀释成浓度为10μm。
21、上述的检测试剂盒包括第七容器，所述第七容器包含所述发夹探针h4，使用前用tris-hcl缓冲溶液稀释成浓度为10μm。
22、上述的检测试剂盒包括第八容器，所述第八容器包含所述氯化血红素(hemin)，优选的所述氯化血红素溶于dmso，使用前用hepes缓冲溶液稀释成浓度20μm。
23、上述的检测试剂盒包括第九容器，所述第九容器包含所述显色底物tmb。
24、上述的检测试剂盒包括第十容器，所述第十容器包含所述20mm的tris-hcl缓冲溶液(20mm三羟甲基氨基甲烷、120mm nacl、20mm kcl、10mm mgcl2、1m hcl调节溶液，ph＝7.4)。
25、上述的检测试剂盒包括第十一容器，所述第十一容器包含所述2m的h2so4溶液。
26、上述的检测试剂盒包括第十二容器，所述第十二容器包含所述25mm hepes缓冲溶液(25mm 4-(2-羟乙基)-1哌嗪乙磺酸、200mm nacl、20mm kcl、0.05％triton x-100、1％dmso，ph＝7.4)。
27、作为同一技术构思，本发明还提供了一种pb2+检测试剂盒的使用方法。
28、上述的检测试剂盒使用方法，上述的检测试剂盒包括第一容器，所述第一容器包含所述pd，使用前用tris-hcl缓冲溶液稀释成浓度为2μm。上述的检测试剂盒包括第二容器，所述第二容器包含所述发夹探针h1，使用前用tris-hcl缓冲溶液稀释成浓度为2μm。上述的检测试剂盒包括第三容器，所述第三容器包含所述三链复合物e1-e2-e3，使用前用tris-hcl缓冲溶液稀释成浓度为10μm。上述的检测试剂盒包括第四容器，所述第四容器包含所述发夹探针f,使用前用tris-hcl缓冲溶液稀释成浓度为10μm。上述的检测试剂盒包括第五容器，所述第五容器包含所述发夹探针h2，使用前用tris-hcl缓冲溶液稀释成浓度为10μm。上述的检测试剂盒包括第六容器，所述第六容器包含所述发夹探针h3，使用前用tris-hcl缓冲溶液稀释成浓度为10μm。上述的检测试剂盒包括第七容器，所述第七容器包含所述发夹探针h4，使用前用tris-hcl缓冲溶液稀释成浓度为10μm。上述的检测试剂盒包括第八容器，所述第八容器包含所述氯化血红素(hemin)，优选的所述氯化血红素溶于dmso，使用前用hepes缓冲溶液稀释成浓度20μm。上述的检测试剂盒包括第九容器，所述第九容器包含所述生色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)和过氧化氢(h2o2)。上述的检测试剂盒包括第十容器，所述第十容器包含所述20mm的tris-hcl缓冲溶液(20mm三羟甲基氨基甲烷、120mm nacl、20mm kcl、10mm mgcl2、1m hcl调节溶液ph值7.4)。上述的检测试剂盒包括第十一容器，所述第十一容器包含所述2m的h2so4溶液。上述的检测试剂盒包括第十二容器，所述第十二容器包含所述25mm hepes缓冲溶液(25mm4-(2-羟乙基)-1哌嗪乙磺酸、200mm nacl、20mm kcl、0.05％triton x-100、1％dmso，ph＝7.4)。
29、上述的检测试剂盒使用方法，所述第一容器取溶液4μl，第二容器取溶液6μl，第三容器取溶液1μl、第四容器取溶液2μl，第五容器取溶液3μl，第六容器取溶液3μl，第七容器取溶液3μl，随后加入不同浓度的pb2+，在37℃下混合反应60min，然后再第八容器取溶液6μl继续反应30min，加入50μl所述第九容器溶液室温反应15min；加入50μl所述第十一容器溶液进行终止反应；最后加入72μl所述第十二容器溶液，紫外可见分光光度计测定450nm
30、处的吸光度。
31、本发明具有突出的实质性特点和显著的技术进步，具体如下：
32、综上，本发明提出了一种基于双价gr-5dnazymes介导的比色传感分析方法，结合edc和y型探针自组装级联放大反应，
33、以实现pb2+的高灵敏检测。该方法显示出四个优点。
34、第一，自主装级联发大反应没有任何分离和洗涤步骤，反应时间短，避免了复杂的设计，并且操作简单。
35、第二，不需要添加任何蛋白酶的整个检测系统有利于降低检测成本，同时避免了蛋白酶失活所导致的检测稳定性下降。
36、第三，使用二价gr-5dnazymes，有效提升了信号扩增速率。
37、第四，使用edc和y型探针自组装级联，产生三价g四链体dnazymes，进一步增强了检测信号的输出，提高了检测灵敏度。
38、说明书附图
39、图1是一种pb2+检测原理图。
40、图2基于型探针自组装双价gr-5dnazymes介导的熵驱动催化反应及y级联放大策略的聚丙烯酰胺凝胶电泳表征图。
41、图3是传感平台检测可行性图。
42、图4是pd的浓度优化图。
43、图5是发夹探针h1浓度优化图。
44、图6是e1-e2-e3混合物浓度优化图。
45、图7是发夹探针f浓度优化图。
46、图8是发夹探针h2、h3、h4浓度优化图。
47、图9是hemin浓度优化图。
48、图10是体系反应时间优化图。
49、图11是级联反应温度优化图。
50、图12是单价和双价gr-5dnazymes级联放大策略的动态比色分析图。
51、图13是不同浓度pb2+检测紫外吸收光谱图。
52、图14是450nm波长下对不同浓度pb2+测定的线性关系图。
53、图15是特异性分析图，分别为检测体系中空白、ni2+、zn2+、ca2+、mn2+、ba2+、co2+。
1.一种铅离子(pb2+)的检测体系，包括氯化血红素、生色底物和反应终止液，其特征在于组成成分还包括pd、发夹探针h1、e1、e2、e3、h2、h3、h4。
2.根据权利要求1所述的pb2+检测体系，所述pd的序列为表一seq idno.1所示序列，所述pd-0的序列为表一seq id no.2所示序列，所述发夹探针h1的序列为表一seq id no.3所示序列，所述发夹探针e1的序列为表一seq idno.4所示序列，所述发夹探针e2的序列为表一seq id no.5所示序列，所述发夹探针e3的序列为表一seq id no.6所示序列，所述发夹探针f的序列为表一seq id no.7所示序列，所述发夹探针yt的序列为表一seq id no.8所示序列，所述发夹探针h2的序列为表一seq id no.9所示序列，所述发夹探针h3的序列为表一seq id no.10所示序列，所述发夹探针h4的序列为表一seq id no.11所示序列。
3.根据权利要求1所述的pb2+检测体系，其特征在于所述显色底物tmb。
4.根据权利要求1所述的pb2+检测体系，其特征在于所述反应终止液为h2so4溶液。
5.一种用于权利要求1所述pb2+的检测体系的方法，其特征在于包括如下步骤：
6.根据权利要求4所述的pb2+检测方法，其特征在于所述退火处理为95℃水浴下5min，缓慢冷却至室温。
7.根据权利要求1～5所述的pb2+检测方法，其特征在于所述pd浓度为40nm、发夹探针h1浓度为60nm、e1-e2-e3浓度为50nm、f的浓度为50nm、发夹探针h2浓度为150nm、h3浓度为150nm、发夹探针h4浓度为150nm，所述氯化血红素浓度为300nm、3,3',5,5'-四甲基联苯胺、过氧化氢浓度均为200μm。
8.一种用于权利要求1所述pb2+检测方法的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第一容器，所述第一容器内含所述pd；
9.一种pb2+检测试剂盒的使用方法，其特征包括权利要求7所述的pb2+检测试剂盒，还包括如下步骤：
