本发明涉及3d打印，尤其涉及一种分级多孔结构细胞自适应生长型骨修复支架制作方法。
背景技术：
1、骨骼是一个具有丰富功能并且拥有多层级结构和组成的复杂系统，研究表明骨骼从宏观尺度、微米尺度到纳米尺度可分为九个层级。骨组织的组成主要是细胞和细胞外基质，包含了有机基质(胶原纤维、无定形基质)和无机基质(羟基磷灰石、骨盐)。为了重现天然骨的解剖结构和组成，目前支架材料正向分级多孔结构和复合基质组成发展。
2、对于大块骨缺损的修复，不断地有研究者探讨不同尺寸(106-212μm，212-300μm，300-400μm，400-500μm和500-600μm)的贯通孔对支架成骨、成血管能力的影响，以定义最合理的孔径大小。有研究发现大孔(≧350μm)支架上有新骨生成，而小孔(≦120μm)支架仅有软骨形成；也有研究发现孔径过大(≧400μm)时支架的骨形成速率受到影响。可见不同研究工作获得的最合理的孔径大小是不一样的，原因是人体骨骼自身的结构和组成非常复杂，是一种多尺度的分级多孔结构，单一结构无法满足骨再生的要求。
3、此外，骨髓间充质干细胞(bmscs)、内皮祖细胞(epcs)等多为贴壁细胞，因此细胞迁移、增值期间需要更多锚点，增加细胞与支架三维表面接触率，如果细胞无法在支架的全部表面黏附反而给细菌生物膜生长预留空间；随着黏附蛋白表达和积累，细胞形成黏连紧密的细胞层或细胞球，需要更大孔径支架为细胞生长、代谢提供空间，此时前期为细胞黏附提供更多锚点的小孔径又会限制细胞层或细胞球长入多孔结构内部，可见单一结构支架无法满足不同尺度细胞的工程组装。
4、目前多孔支架的主要制备方法包括3d打印、静电纺丝和冷冻干燥等技术，这些技术单独使用尚无法在同一空间内一步获得分级多孔结构。
5、公开的文献中，例如论文“3d打印多孔钛合金丝素蛋白水凝胶涂层性能研究”，采用3d打印技术制备多孔钛合金植体试件，对试样进行喷砂处理并超声清洗，采用光固化的方法在多孔钛合金表面和孔隙内部形成丝素蛋白水凝胶，对形成的水凝胶进行表面表征评价。水凝胶不是多孔结构，因此此方法无法获得多尺度的多孔结构。
6、再比如论文“3d打印tpms梯度多孔钛合金结构的力学性能及生物学性能研究”，采用基于三周期极小曲面结构(tpms)设计了两种不同方向孔隙率梯度变化的多孔支架，以模拟骨骼的生物力学特性，并设计了均匀多孔支架做对照。这种方法同样无法获得分级多孔结构，梯度多孔结构均为宏观大孔。
7、对于大块骨缺损的修复，不断地有研究者探讨用于骨修复的支架材料的不同尺寸(106-212μm，212-300μm，300-400μm，400-500μm和500-600μm)的孔隙对成骨、成血管能力的影响，以定义最合理的孔径大小。但研究表明单一孔隙结构的支架无法满足成骨、成血管的不同需要，以及不同尺度细胞的工程组装需要。因为人体骨骼自身的结构就非常复杂，是一种多尺度的分级多孔结构。
8、现有技术的缺点或急需解决的技术问题是骨修复支架材料的单一孔隙结构无法满足成骨、成血管的不同需要，或不同尺度细胞的工程组装。理想的骨修复支架材料应满足如下要求：早期，具有低孔隙率的微孔结构及与ecm相似的组成，可提供更多细胞黏附的活性位点和伪足铺展的支撑点；后期，具有宏观大孔结构及促进矿化的组成，为黏附紧密的细胞长入中空结构提供空间，并促进成血管化和成骨矿化。而目前多孔支架的主要制备方法包括3d打印、静电纺丝和冷冻干燥等技术，这些技术尚无法在同一空间内一步获得分级多孔结构。
技术实现思路
1、基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种分级多孔结构细胞自适应生长型骨修复支架制作方法，结合金属3d打印技术先构建宏观贯通大孔，贯通大孔有利于组织供氧、营养供应级废物代谢及血管生成；随后对3d打印多孔钛支架三维表面进行表面亲水处理，并利用冷冻干燥技术在宏观大孔内的亲水表面构建胶原纤维微米级网络结构，最终获得在结构、组成以及空间上的仿骨支架材料。
2、本发明提出的一种分级多孔结构细胞自适应生长型骨修复支架制作方法，包括以下步骤：
3、s1、通过选区激光融化技术制备具有贯通大孔的slm多孔钛支架，为适宜血管长入设计贯通大孔，结合金属选区激光融化技术激光成型，改变激光加工生产工艺的成型倾斜角度、激光功率、扫描速度、扫描间距参数，获得贯通大孔结构；
4、s2、slm多孔钛表面阳极氧化制备tio2纳米管，对多孔钛支架样件进行丙酮、乙醇、去离子水除油处理，并利用hf酸与hno3酸配置成的溶液在超声条件下进行酸洗处理，最后清洗晾干；以多孔钛支架为阳极，以铂网为阴极，利用同轴氧化法在多孔钛三维表面制备tio2纳米管，通过调节阳极氧化的电压和氧化时间参数控制纳米管的形貌；
5、s3、slm多孔钛-矿化胶原分级多孔结构的的制备，利用冷冻干燥方式在宏观尺度slm多孔钛内构建微米尺度ⅰ型胶原纤维网络以模拟人骨多层级结构；利用仿生矿化方法，在胶原纤维表面以ca-gp和cacl2为钙磷源，沉积可降解纳米hap模拟ecm和骨基质组成。
6、优选地，所述步骤s1中，选用的原材料钛金属粉末为ta2金属粉末，粒径20-40μm，纯度>99.5％。
7、优选地，所述步骤s1中，所述贯通大孔多孔钛的孔径为孔径梯度结构，沿厚度方向孔径由大变小，外部粗孔层结构为孔径500-600μm、棱柱厚度100-150μm、孔隙率70-90％的均匀三维空间连通多孔结构；内层细孔层结构为孔径200-300μm、棱柱厚度100-150μm、孔隙率50-70％的均匀三维空间连通多孔结构。
8、优选地，所述步骤s1中，激光功率为90w-100w，激光扫描速度为380—420mm/s，扫描间距为55-65μm、光斑直径为70-80μm，利用扫描电镜观察材料的表面微米级球形粉末粒径及间距。
9、优选地，所述步骤s1中，在打印后对产品进行超声清洗去除表面残留多余粉末、室温晾干。
10、优选地，所述步骤s2中，具体包括以下步骤：
11、s21、除油，将slm多孔钛支架样件分别浸润在50ml丙酮、乙醇、去离子水中，在超声条件下处理10～30min，取出样件并用去离子水冲洗干净；
12、s22、酸侵蚀，将5～15ml·l-1hf与10～30ml·l-1hno3配置成酸浸液，hf:hno3:h2o＝1:4:5，将经除油处理的样件放入酸浸液中，在超声条件下清洗20～40s，取出后用去离子水仍在超声条件下冲洗干净，去除表面的残留酸液，自然晾干，备用；
13、s23、阳极氧化电解液溶液的配制；
14、s24、阳极氧化制备tio2纳米管薄膜。
15、优选地，所述步骤s23中阳极氧化电解液溶液的配制方法为：
16、移液枪分别取1～3mlhf，取2～5ml去离子水，加入90～95ml二乙二醇溶剂中，电解液静置10min，300～500r/min磁力搅拌30min，将电解液充分混合均匀，温度稳定在10～40℃。
17、优选地，所述步骤s24中阳极氧化制备tio2纳米管薄膜的方法为：
18、s241、以slm钛植入体为工作电极，铂网为对电极，在磁力搅拌速度为300～500r/min的条件下，将样品浸入步骤23制备的电解液；
19、s242、施加40v～100v的恒电位下，阳极氧化2h～12h，实验温度始终稳定在温度稳定在10～40℃；
20、s243、将阳极氧化获得的样品表面用去离子水冲洗10～15次，在50～70℃下烘干。
21、优选地，所述步骤s3中，具体包括以下步骤：
22、s31、前处理，在丙酮中超声10分钟，用去离子水冲洗3次，室温晾干；
23、s32、采用冰醋酸调节ⅰ型胶原蛋白ph为中性，缓慢加入alp溶液，慢速搅拌30min，并与alp溶液的混合物装入透析袋中，密封后转移至ca-gp和cacl2的混合溶液中，ca:p＝1.67，经过37℃温度变化，分别矿化24h、48h和72h后，胶原蛋白自组装为胶原纤维形成凝胶；
24、s33、将自组装完成后的ⅰ型胶原用去离子水超声清洗，和slm多孔钛支架共同放入自制的模具中，然后置于-80℃冰箱中过夜，置于冷冻干燥机中冷冻干燥，得到hap-胶原-多孔钛支架；
25、s34、调整胶原溶液浓度，控制胶原纤维孔隙率和孔径；
26、s35、用uv、xrd、xps和ft-ir检测多孔钛支架内胶原蛋白、hap的特征性元素、晶体结构和基团。
27、与现有的技术相比，本发明的有益效果是：利用3d打印技术先构建宏观贯通孔隙多孔钛金属支架，贯通大孔有利于组织供氧、营养供应级废物代谢及血管生成；随后对3d打印多孔钛支架三维表面进行表面亲水处理，亲水处理有利于后续胶原纤维网络的构建；利用冷冻干燥技术在宏观大孔内的亲水表面构建ⅰ型胶原纤维微米级网络结构，胶原是晡乳动物体内含量最多的一类蛋白质，具有良好的物相容性和生物降解能力，可为细胞黏附提供更多位点，提高成骨速率及支架表面与周围组织的骨整合；由于胶原的降解速率可控，其降解后可为后期成血管、成骨分化提供空间及其所需活性成分。
1.一种分级多孔结构细胞自适应生长型骨修复支架制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种分级多孔结构细胞自适应生长型骨修复支架制作方法，其特征在于，所述步骤s1中，选用的原材料钛金属粉末为纯ti金属或钛合金，粒径20-40μm，纯度>99.5％，所述纯ti金属包括ta1、ta2、ta3、ta4，所述钛合金为ti-6al-4v。
3.根据权利要求1所述的一种分级多孔结构细胞自适应生长型骨修复支架制作方法，其特征在于，所述步骤s1中，所述贯通大孔多孔钛的孔径为孔径梯度结构，沿厚度方向孔径由大变小，外部粗孔层结构为孔径500-600μm、棱柱厚度100-150μm、孔隙率70-90％的均匀三维空间连通多孔结构；内层细孔层结构为孔径200-300μm、棱柱厚度100-150μm、孔隙率50-70％的均匀三维空间连通多孔结构。
4.根据权利要求1所述的一种分级多孔结构细胞自适应生长型骨修复支架制作方法，其特征在于，所述步骤s1中，激光功率为90w-100w，激光扫描速度为380-420mm/s，扫描间距为55-65μm、光斑直径为70-80μm，利用扫描电镜观察材料的表面微米级球形粉末粒径及间距。
5.根据权利要求1所述的一种分级多孔结构细胞自适应生长型骨修复支架制作方法，其特征在于，所述步骤s1中，在打印后对产品进行超声清洗去除表面残留多余粉末、室温晾干。
6.根据权利要求1所述的一种分级多孔结构细胞自适应生长型骨修复支架制作方法，其特征在于，所述步骤s2中，具体包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的一种分级多孔结构细胞自适应生长型骨修复支架制作方法，其特征在于，所述步骤s23中阳极氧化电解液溶液的配制方法为：
8.根据权利要求6所述的一种分级多孔结构细胞自适应生长型骨修复支架制作方法，其特征在于，所述步骤s24中阳极氧化制备tio2纳米管薄膜的方法为：
9.根据权利要求1所述的一种分级多孔结构细胞自适应生长型骨修复支架制作方法，其特征在于，所述步骤s3中，具体包括以下步骤：
