本发明涉及生物检测，尤其涉及一种降钙素原pct蛋白抗体、定量检测pct蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法。
背景技术：
1、降钙素原(procalcitonin，pct)，是一种位于人类第11号染色体上的基因所编码的前体蛋白。该基因由6个外显子和5个内含子组成，总长7600bp，其中编码区长度为2800bp。在甲状腺滤泡旁细胞的粗面内质网内，这一基因的转录后产生了降钙素原前体，随后，在内源多肽酶的作用下，经过修饰加工，最终生成了由116个氨基酸组成的终产物，即pct。
2、pct在医学领域中具有重要的应用价值，特别是在感染性疾病和炎症状态的诊断和监测方面。pct主要在细菌毒素和炎性细胞因子的刺激下产生。在非感染性炎症状态下，血清中的pct通常不升高，而在感染性炎症过程中，pct的生成非常迅速。在受到内毒素刺激后，pct的水平在2～6小时内显著上升，而且在严重全身感染的情况下，pct的血液浓度在24小时内可能高达正常水平的1000倍。因此，pct不仅能够早期识别细菌感染，还是败血症的预警和诊断指标。此外，pct与细菌感染的严重程度呈正相关，其上升或下降趋势直接反映了疾病的恶化或好转。因此，pct的检测在细菌性感染、败血症、多器官功能衰竭综合征(mods)的鉴别诊断、预后评估、治疗效果监测以及合理应用抗菌药物等方面具有重要的参考价值。
3、pct的检测方法已经获得美国食品药品管理局(fda)的许可。早期，pct的检测主要使用凝胶层析法和高效液相色谱法，这两种方法存在操作复杂、耗时较长，且难以自动化的问题。然而，近年来，pct的检测方法已经转向采用免疫学方法，这些方法具有特异性强、灵敏度高以及易于操作等优点。免疫学方法包括双抗夹心免疫化学法、胶体金法和放射免疫法等。这些方法的前提是制备对pct具有高度特异性的单克隆抗体，因为在健康人的血浆中，pct的含量非常低，通常低于0.2ng/ml。因此，制备pct特异性抗体对于免疫学检测具有关键意义，它不仅扩大了pct在临床中的应用范围，还有助于降低医疗成本。
4、目前，国内用于制备pct蛋白胶乳比浊试剂盒的单克隆抗体大多为鼠源或者兔源的抗体，在亲和力、特异性上会存在一些缺陷，由这类抗体制备的胶乳比浊试剂盒检测灵敏度低，非特异性干扰比较严重，严重影响试剂盒在临床检测上的应用。
5、据此，目前对于pct蛋白抗体及检测试剂盒制备工艺还有较大改善空间，本领域针对更优的pct的单克隆抗体及试剂盒制备工艺仍然存在着强烈需求。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题在于提供一种pct蛋白抗体、定量检测pct蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备，本发明抗体亲和力高、特异性好，基于该抗体的试剂盒灵敏度高、特异性好、抗干扰能力强。
2、本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
3、一种pct蛋白抗体，包括抗人pct蛋白单克隆抗体i和/或抗人pct蛋白单克隆抗体ii；
4、所述抗人pct蛋白单克隆抗体i包括轻链和重链；所述轻链的氨基酸序列如seq idno.1所示，重链氨基酸序列如seq id no.2所示；
5、所述抗人pct蛋白单克隆抗体ii由纳米抗体vhh及人源igg1的fc融合而成，融合后的序列为seq id no.3所示。
6、作为本发明的优选方式之一，所述抗人pct蛋白单克隆抗体i与抗人pct蛋白单克隆抗体ii的抗体c端还分别融合有strep ii标签，所述strep ii标签的氨基酸序列如seqid no.4所示。
7、作为本发明的优选方式之一，所述strep ii标签无需生物素化，能够直接与链霉亲和素结合。
8、一种定量检测pct蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，包括上述pct蛋白抗体。
9、作为本发明的优选方式之一，所述定量检测pct蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒具体包括试剂r1、试剂r2和校准品；
10、所述试剂r1包括：稳定剂，促凝剂，阻断剂，防腐剂，缓冲液；
11、所述试剂r2包括：稳定剂，防腐剂，表面活性剂，缓冲液，包被pct蛋白抗体的胶乳颗粒；
12、所述校准品包括：防腐剂，稳定剂，pct抗原，缓冲液；
13、其中，所述试剂r2的“包被pct蛋白抗体的胶乳颗粒”中，具体采用抗人pct蛋白单克隆抗体i和抗人pct蛋白单克隆抗体ii两株抗体，且两株抗体分别与胶乳颗粒之间通过“链酶亲和素-strep-ii”连接。
14、作为本发明的优选方式之一，所述试剂r1中：
15、稳定剂为10mg/ml海藻糖；
16、促凝剂为终浓度0.5％的peg6000；
17、阻断剂为终浓度100ug/ml的类风湿因子阻断剂；
18、防腐剂为0.05％ proclin300；
19、缓冲液包括50mm tris-hcl缓冲液和2％ nacl，缓冲液ph 7.5。
20、作为本发明的优选方式之一，所述试剂r2中：
21、稳定剂包括5mg/ml牛血清白蛋白和15mg/ml海藻糖；
22、防腐剂为0.05％ proclin300；
23、表面活性剂为0.01％ tween 20；
24、缓冲液为50mm、ph7.5的hepes缓冲液；
25、包被pct蛋白抗体的胶乳颗粒，终浓度0.15％。
26、作为本发明的优选方式之一，所述校准品中：
27、防腐剂为0.05％叠氮钠；
28、稳定剂包括15mg/ml牛血清白蛋白和100mg/ml海藻糖；
29、pct抗原为浓度0～100ng/ml的pct蛋白抗原；
30、缓冲液为浓度50mm、ph7.2的tris-hcl缓冲液。
31、其中，pct蛋白抗原可直接选择市售产品，例如，安徽千诚生物技术有限公司生产的“重组人pct抗原”，来源于ecoli，人，纯度≥95％，货号：ag00402；也可采用现有市场的其他体外系统表达并纯化的重组pct蛋白。
32、作为本发明的优选方式之一，所述“包被pct蛋白抗体的胶乳颗粒”通过如下方法获得：
33、(1)胶乳颗粒的洗涤及活化
34、①将胶乳颗粒加入mes洗涤液离心，弃上清，重复洗涤若干次；
35、②将沉淀重悬于mes偶联缓冲液中，并加入edc活化；
36、③活化后的胶乳颗粒用mes偶联缓冲液洗涤后重悬；
37、(2)链酶亲和素偶联
38、①取活化洗涤后的胶乳溶液，加入链酶亲和素；混匀后摇床偶联；
39、②用hepes缓冲液洗涤微球颗粒，重复若干次；
40、③加入封闭剂封闭；
41、(3)pct蛋白抗体与链酶亲和素包被颗粒的连接
42、将步骤(2)制得的胶乳颗粒溶液与预先混合的两株pct抗体混合，置于摇床中孵育，形成“胶乳颗粒-链酶亲和素-pct蛋白抗体的复合物”，即目标所需的“包被pct蛋白抗体的胶乳颗粒”。
43、作为本发明的优选方式之一，所述试剂r2的“包被pct蛋白抗体的胶乳颗粒”中，抗人pct蛋白单克隆抗体i和抗人pct蛋白单克隆抗体ii之间的混合质量比为2:1。
44、一种上述定量检测pct蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
45、(1)配制试剂r1：
46、将试剂r1的稳定剂、促凝剂、阻断剂、防腐剂、缓冲液于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r1；
47、(2)配制试剂r2的稀释缓冲液：
48、将试剂r2的稳定剂、防腐剂、表面活性剂、缓冲液进行混合，获得试剂r2的稀释缓冲液；
49、(3)配制试剂r2：
50、①胶乳颗粒的洗涤及活化
51、将胶乳颗粒加入mes洗涤液离心，弃上清，重复洗涤若干次；
52、将沉淀重悬于mes偶联缓冲液中，并加入edc活化；
53、活化后的胶乳颗粒用mes偶联缓冲液洗涤后重悬；
54、②链酶亲和素偶联
55、取活化洗涤后的胶乳溶液，加入链酶亲和素；混匀后摇床偶联；
56、用hepes缓冲液洗涤微球颗粒，重复若干次；
57、加入封闭剂封闭；
58、③pct蛋白抗体与链酶亲和素包被颗粒的连接
59、将步骤②制得的胶乳颗粒溶液与“抗人pct蛋白单克隆抗体i、抗人pct蛋白单克隆抗体ii”两种抗体混合，置于摇床中孵育，形成“胶乳颗粒-链酶亲和素-pct蛋白抗体的复合物”，并用步骤(2)制得的稀释缓冲液进行稀释，稀释至目标浓度；
60、(4)配制校准品：
61、将校准品的防腐剂、稳定剂、pct抗原和缓冲液进行混合，获得校准品。
62、作为本发明的优选方式之一，本发明试剂盒可在半自动、全自动生化分析仪上用于定量检测人体血液中pct蛋白的含量，其中所述血液包括全血、血清及血浆。
63、本发明相比现有技术的优点在于：
64、(1)本发明抗体为自研抗体，进行了三方面的改进：①对抗体序列进行了筛选，获得了亲和力高、特异性好的两株抗体；②将其中一个抗体fc为改造为人源fc，从而大大减少异噬性抗体带来的检测干扰；③在两个抗体的c端加入strep-ii标签，便于让抗体通过“链霉亲和素-strep-ii连接系统”偶联到胶乳微球上；基于上述自研抗体的本发明试剂盒灵敏度高、特异性好、抗干扰能力强；
65、(2)本发明试剂r2中的胶乳颗粒与pct蛋白抗体为间接连接系统，所述间接连接系统为“链霉亲和素-strep-ii连接系统”；间接链接的抗体能够最大程度的保留抗体活性，使抗体能够更精准地发挥作用，极大提高检测灵敏度；
66、(3)本发明试剂盒与现有试剂盒对同一样本的pct蛋白检测结果经统计分析，结果相关性好，结果准确可靠，并无显著差异，在临床上可替代现有的产品使用，并能显著降低检测成本。
1.一种pct蛋白抗体，其特征在于，包括抗人pct蛋白单克隆抗体i和/或抗人pct蛋白单克隆抗体ii；
2.根据权利要求1所述的pct蛋白抗体，其特征在于，所述抗人pct蛋白单克隆抗体i与抗人pct蛋白单克隆抗体ii的抗体c端还分别融合有strep ii标签，所述strep ii标签的氨基酸序列如seq id no.4所示。
3.一种定量检测pct蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的pct蛋白抗体。
4.根据权利要求3所述的定量检测pct蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，具体包括试剂r1、试剂r2和校准品；
5.根据权利要求4所述的定量检测pct蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，其特征在于，所述试剂r1中：
6.根据权利要求4所述的定量检测pct蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，其特征在于，所述试剂r2中：
7.根据权利要求4所述的定量检测pct蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，其特征在于，所述校准品中：
8.根据权利要求4所述的定量检测pct蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，其特征在于，所述“包被pct蛋白抗体的胶乳颗粒”通过如下方法获得：
9.根据权利要求4所述的定量检测pct蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，其特征在于，所述试剂r2的“包被pct蛋白抗体的胶乳颗粒”中，抗人pct蛋白单克隆抗体i和抗人pct蛋白单克隆抗体ii之间的混合质量比为2:1。
10.一种如权利要求3～9任一所述的定量检测pct蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
