本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种药物组合物及其制备和应用。
背景技术：
1、肿瘤免疫疗法作为癌症治疗中的突破性治疗策略，可通过刺激免疫系统使肿瘤患者获得持久的保护性抗肿瘤反应，这一治疗策略在过去的30年里已经取得了快速发展，目前在一些难治性肿瘤中表现出显著而持久的临床收益，并且广泛应用于多种癌症类型的治疗中。然而由于肿瘤免疫微环境的复杂性与异质性，在实际临床实践中仍然存在大量实体瘤患者无法对肿瘤免疫疗法产生足够抗肿瘤免疫响应，导致免疫疗法在某些临床环境中无法表现出令人满意的效果。因此如何改善肿瘤微环境，增强肿瘤免疫响应成为目前亟需解决的重要问题。
2、肿瘤部位浸润性t细胞是介导有效抗肿瘤免疫反应的关键因素，然而肿瘤可通过建立免疫抑制环境支持免疫逃避。肿瘤微环境在不同肿瘤中高度异质，根据肿瘤部位免疫细胞的类型、数量和位置，肿瘤免疫微环境可以大致分为两类：热肿瘤和冷肿瘤。其中热肿瘤具有更高的细胞毒性t淋巴细胞浸润，对免疫治疗有良好响应，但遗憾的是，更多情况下恶性肿瘤是对免疫治疗不敏感的冷肿瘤，并导致患者预后不良以及整体生存期的缩短。因此寻找一种可有效激活冷肿瘤免疫反应的策略可有效解决肿瘤部位免疫响应不良的问题。
3、热肿瘤的一个重要特征是i型干扰素(type i interferon，ifn)和ifn诱导基因的高表达，目前已在多种肿瘤中发现ifn与肿瘤微环境中cd8+t细胞及相关细胞标志物之间存在正相关。ifn在抗肿瘤免疫反应启动的早期阶段至关重要，缺乏干扰素受体的小鼠无法在体内诱导肿瘤特异性cd8+t细胞的增殖与分化。ifn主要由天然免疫细胞树突状细胞(dendritic cell，dc)分泌，dc细胞是抗免疫应答中重要的抗原呈递细胞，也是最早对肿瘤产生应答并调控免疫反应的核心免疫细胞。在肿瘤发生早期，dc细胞首先浸润肿瘤部位并出现在肿瘤引流淋巴结中，而ifn信号的缺乏会直接影响cd8+t细胞的增殖、招募与激活。因此ifn在抗肿瘤免疫中发挥至关重要的桥梁作用，肿瘤浸润树突状细胞分泌ifn的能力是影响肿瘤t细胞浸润的关键因素，因此寻找合适策略增加肿瘤浸润树突状细胞ifn的表达，有希望重塑肿瘤微环境，并使免疫反应惰性的冷肿瘤转化为免疫激活的热肿瘤成为可能。
4、cgas-sting信号通路是调控树突状细胞分泌ifn的核心信号通路，树突状细胞通过该信号通路感知外源性dna并启动天然免疫应答，但由于该通路的重要免疫调节功能，该信号通路的激活也受到机体的严格调控。dna是宿主细胞在微生物或病毒感染过程中重要的病原体相关分子模式，当它被树突状细胞所捕获时，可被胞浆中的cgas结合并激活cgas的酶活，并以atp和gtp为底物合成2′3′-cgamp；随后2′3′-cgamp与位于内质网的sting结合，sting在感知该信号后启动从内质网向高尔基体的囊泡运输；sting到达高尔基体后进一步招募激活磷酸化tbk1并形成蛋白二聚体；蛋白二聚体共同招募irf3并使irf3磷酸化与二聚化；磷酸化与二聚化的irf3发挥转录因子活性，并最终进入细胞核，启动i型干扰素和其他免疫调节因子的表达。机体为避免cgas-sting信号通路出现不受控的过度激活，采取了多种方式限制该通路的信号转导，导致cgas-sting信号通路的激活涉及多个生物学过程，关键环节不仅仅包括信号感受器sting的激活，还涉及sting的跨细胞器转运以及sting-tbk1复合体的形成,任何一个关键环节的调控缺失都会影响cgas-sting信号通路的激动效率。cgas-sting信号通路的复杂的调控过程不仅使sting激动剂的开发充满挑战，也为更高效的sting激动策略的开发提供了机会。
5、目前的cgas-sting信号通路激动策略以基于信号感受器sting蛋白开发的单靶点激动剂为主，通过给予信号感受器sting通路起始信号，启动下游信号转导，目前基于此信号通路开发的一系列sting激动剂已在肿瘤免疫治疗中显示出了巨大应用潜力。根据结构特征可将其分为环化二核苷酸(cyclic dinucleotides，cdn)类sting激动剂与金属离子型sting激动剂，其中锰离子是近些年发现的最具临床应用潜力的sting激动剂，可通过激活cgas继而激活sting最终启动信号转导。锰离子相较其他有机小分子类sting激动剂不仅拥有更好的理化稳定性与更低的使用成本，而且也是目前唯一被fda批准用于临床的膳食补充剂，因此将锰离子通过全身给药用于肿瘤免疫治疗拥有巨大的临床应用前景。但锰离子相对于有机小分子sting激动剂又存在药代动力学不稳定以及在肿瘤组织分布较差等问题，因此如何改善锰离子药代动力学以及肿瘤蓄积进而提高cgas-sting信号通路激动效率成为目前急需解决的问题。
6、目前针对锰离子的上述临床应用障碍已经有大量研究试图予以解决，其中将游离锰离子通过矿化固定并使用纳米脂质体装载改善沉淀物理性质是一种极具希望的解决策略，目前比较成功的代表性解决方案包括：使用传统微乳法制备工艺的无机磷酸-锰矿化内核纳米脂质体，以及使用传统薄膜分散法制备工艺的环化双核苷酸(cyclicdinucleotides，cdn)-锰矿内核纳米脂质体。尽管前者的研究解决了锰离子的递送问题，使金属离子的高效系统性给药成为可能，但基于锰离子的sting激动剂效率仍有较大提升空间，而后者虽然在前者基础使用有生物活性的cdn矿化锰离子并制备纳米颗粒，但cdn与锰离子针对同一靶点激动，激动效率仍然受到sting激活后跨细胞器转运与tbk1招募过程的限制。并且两种解决方案同时存在制备工艺复杂不利于工业放大以及进一步临床转化的问题。
7、尽管现有研究已经使关键问题的解决看到了希望，但现有解决方案仍然无法突破传统单靶点sting激动策略以及传统的纳米脂质体制备工艺及递送系统递送效率的限制，导致锰离子的cgas-sting激动效率被sting蛋白信号感知能力牢牢限制，而对信号转导效率影响更为关键的下游效应环节：sting的跨细胞器转运过程完全缺乏调控；复杂的纳米脂质体制备工艺也导致在临床前研究表现出巨大临床应用潜力的脂质体由于无法工业标准化生产而前功尽弃。因此随着此领域研究的逐渐深入，亟需提供更高效的sting激动策略与新型纳米脂质体制备工艺。
技术实现思路
1、本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种药物组合物及其制备和应用。本发明提供的药物组合物包括pcsk9抑制剂和sting激动剂，利用两者的生物学功能和化学性质的协同，实现了同时调控sting激活与sting跨细胞器转运，最终强效激活cgas-sting信号通路的生物学目的，同时还开发了基于微流控的制备工艺，进一步解决了后续的工业放大问题，具有巨大潜力。
2、为此，本发明第一方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包括pcsk9抑制剂和sting激动剂；
3、所述sting激动剂包括选自锰离子、环状二聚核苷酸中的至少一种。
4、发明人发现，可抑制pcsk9蛋白表达与功能的pcsk9抑制剂不仅可以用于高血脂以及心血管疾病的治疗，其在肿瘤免疫治疗中也有令人意想不到的优势，即可通过不依赖sting激动剂的方式影响sting通路激活。通过将pcsk9抑制剂与sting激动剂联合使用，发现两者协同强效激活sting信号通路与i型干扰素的释放，而单独使用pcsk9抑制剂或sting激动剂则缺乏这一效应。
5、根据本发明的实施方案，所述环状二聚核苷酸包括选自cgamp、c-di-amp中的至少一种。
6、根据本发明的实施方案，所述药物组合物进一步包括药物递送载体。
7、根据本发明的实施方案，所述药物组合物进一步包括药学上可接受的载体或辅料。
8、根据本发明的实施方案，所述药物递送载体具有经聚多糖修饰的磷脂外壳，所述磷脂外壳包裹所述pcsk9抑制剂和sting激动剂。通过对磷脂外壳表面进行聚多糖修饰，例如进行具有cd44靶向与肿瘤组织靶向功能的天然多糖透明质酸修饰，进一步赋予了药物组合物cd44靶向与肿瘤靶向蓄积的能力。
9、根据本发明的实施方案，所述pcsk9抑制剂包括选自靶向pcsk9的sirna、与pcsk9蛋白特异性结合的抗体、通过抑制pcsk9内质网到高尔基体的囊泡运输，进而抑制pcsk9分泌的小分子化合物中的至少一种。
10、根据本发明的实施方案，所述小分子化合物包括选自al-1576、cvi-lm001中的至少一种。
11、根据本发明的实施方案，所述pcsk9抑制剂选自靶向pcsk9的sirna。
12、根据本发明的实施方案，所述磷脂外壳包括选自阳离子脂质、聚乙二醇脂质、辅助脂质中的至少一种。
13、根据本发明的实施方案，所述阳离子脂质包括选自dlin-mc3-dma、dlin-kc2-dma、dlin-dma、dodma、dodap、dotap、dotma、dc-chol中的至少一种。
14、根据本发明的实施方案，所述聚乙二醇脂质包括选自dmg-peg、dspe-peg、dope-peg、dsg-peg中的至少一种。
15、根据本发明的实施方案，所述辅助脂质包括选自dope、dspc、dppc、dmpc、dopc、dspe、alc-0159中的至少一种。
16、根据本发明的实施方案，所述阳离子脂质、聚乙二醇脂质、辅助脂质的摩尔比为(1-1)：(1-10)：(1-50)。
17、根据本发明的实施方案，所述磷脂外壳包括dotap、dspe-peg、dope。
18、根据本发明的实施方案，所述聚多糖包括选自透明质酸、海藻酸钠、葡聚糖及其衍生物中的至少一种。
19、根据本发明的实施方案，所述聚多糖选自透明质酸。
20、本发明第二方面提供一种第一方面所述的药物组合物的制备方法，包括：
21、(1)分别配制pcsk9抑制剂溶液和sting激动剂溶液，向所述pcsk9抑制剂溶液中加入sting激动剂溶液，得到水相组分；
22、(2)制备未经聚多糖修饰的磷脂外壳，得到醇相组分；
23、(3)将所述水相组分和醇相组分混合，并向其中加入聚多糖溶液，得到所述药物组合物。
24、本发明充分利用pcsk9抑制剂和sting激动剂螯合的化学特征，摒弃了传统微乳法与薄膜分散法为基础的脂质体制备工艺，开发了一种在稳定性与可控性方面明显优于现有方案的适于工业放大生产的制备策略。此制备方法在制备功能性药物载体方面具有独特的优势，大大简化制备工艺，利于工业生产放大，同时还使用了更加安全的生产辅料，有利于该核酸药物递送系统的临床应用转化。
25、根据本发明的实施方案，步骤(1)中所述pcsk9抑制剂溶液浓度为1-999μg/ml，所述sting激动剂溶液浓度为1-999mmol/ml。
26、根据本发明的实施方案，所述步骤(3)进一步包括：
27、将所述水相组分和醇相组分通过微流控芯片混合。
28、根据本发明的实施方案，所述通过微流控芯片混合的过程中流速为5-20ml/min。
29、根据本发明的实施方案，所述水相组分和醇相组分的体积比为(1:1)-(1:10)。
30、根据本发明的实施方案，所述制备方法进一步包括：
31、将得到的药物组合物进行透析、过滤操作。
32、本发明第三方面提供第一方面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗肿瘤、预防肿瘤复发或转移。
33、根据本发明的实施方案，所述肿瘤包括选自结肠癌、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌中的至少一种。
34、本发明第四方面提供一种疫苗，所述疫苗包括抗原和第一方面所述的药物组合物。
35、根据本发明的实施方案，所述抗原包括肿瘤抗原或病原菌抗原。
36、本发明第五方面提供第四方面所述的疫苗在预防或治疗肿瘤或感染性疾病中的用途。
37、本发明相对于现有技术具有以下有益效果：
38、(1)cgas-sting信号通路激动策略更高效：本发明提供了一种基于生物学协同的cgas-sting激动策略，即利用pcsk9抑制剂和sting激动剂的生物学功能的协同，突破了传统单靶点sting激动剂研发策略对cgas-sting信号通路免疫治疗潜力的限制，为未来更高效的sting激动策略的发现建立生物学基础，也为用于全身癌症治疗的纳米颗粒递送系统建立新的平台；
39、(2)制备工艺简便，易于工业生产放大：此制备方法充分利用pcsk9抑制剂和sting激动剂在碱性环境螯合/酸性环境解离的化学性质，极大简化了制备工艺，不仅实现了快速、可控、标准化制备装载pcsk9抑制剂和sting激动剂矿化内核的药物组合物的目标，而且可以为进一步优化药物组合物表面性质提供了便利。本发明采用的微流控工艺在稳定性与可控性方面明显优于传统的微乳法和薄膜分散法，有利于将该工艺运用到大规模工业生产中，最终实现通过全身静脉注射并递送活性组分启动强大的抗肿瘤免疫反应的临床目标。
40、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
1.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括pcsk9抑制剂和sting激动剂；
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物进一步包括药物递送载体；
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物递送载体具有经聚多糖修饰的磷脂外壳，所述磷脂外壳包裹所述pcsk9抑制剂和sting激动剂。
4.根据权利要求1-3任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述pcsk9抑制剂包括选自靶向pcsk9的sirna、与pcsk9蛋白特异性结合的抗体、通过抑制pcsk9内质网到高尔基体的囊泡运输，进而抑制pcsk9分泌的小分子化合物中的至少一种；
5.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述磷脂外壳包括选自阳离子脂质、聚乙二醇脂质、辅助脂质中的至少一种；
6.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述聚多糖包括选自透明质酸、海藻酸钠、葡聚糖及其衍生物中的至少一种；
7.一种权利要求3-6任一项所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，包括：
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述pcsk9抑制剂溶液浓度为1-999μg/ml，所述sting激动剂溶液浓度为1-999mmol/ml。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)进一步包括：
10.根据权利要求7-9任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法进一步包括：
11.权利要求1-6任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途，其特征在于，所述药物用于治疗肿瘤、预防肿瘤复发或转移；
12.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包括抗原和权利要求1-6任一项所述的药物组合物。
13.根据权利要求12所述的疫苗，其特征在于，所述抗原包括肿瘤抗原或病原菌抗原。
14.权利要求12或13所述的疫苗在预防或治疗肿瘤或感染性疾病中的用途。
