本公开文本涉及分子生物学、基因疗法、以及用于修饰rna分子的表达和活性的组合物和方法。
背景技术：
1、对于提供用于校正功能障碍信使rna的有效疗法，本领域存在长期但未满足的需求。
2、核内小rna(snrna)是最小类型的rna之一，平均大小为约150个核苷酸。snrna是功能性非编码rna。真核基因组编码多种非编码rna(一类高度丰富的rna，如snrna)，所述非编码rna位于细胞核中，在内含子剪接和rna加工中具有重要功能。在前mrna剪接过程中，snrna能够与其他蛋白质一起形成核糖核蛋白颗粒(snrnp)。这些snrnp和另外的蛋白质形成结合至未剪接的前mrna转录物的大颗粒复合物(剪接体)。除了剪接之外，snrna还在新生转录物的核成熟、基因表达调节、在非经典系统中作为剪接供体以及在复制依赖性组蛋白mrna的3'端加工中起作用。可以将u7 snrna编程为结合和调节mrna，而不表达外源蛋白质，但是仍然需要开发一种使免疫原性风险最小化的高度特异性地靶向mrna的治疗剂。此外，这些经编程的snrna的小尺寸为开发单载体、高度特异性(等位基因特异性)、单靶标和多靶标基因治疗方法创造了机会。
3、因此，本公开文本提供了包含由工程化snrna构成的新的治疗性靶向rna的平台的组合物和方法。
技术实现思路
1、本公开文本提供了基因疗法组合物，所述基因疗法组合物包含新的治疗性靶向rna的平台，所述平台由包含工程化snrna茎环(esl)的工程化snrna(esnrna)构成。
2、本文公开了包含核酸分子的组合物和包含工程化snrna(esnrna)的载体。
3、本文公开了靶向rna的核酸分子，所述靶向rna的核酸分子包含工程化snrna(esnrna)系统，其中所述esnrna系统包含工程化茎环(esl)。
4、在一个实施方案中，所述esnrna包含5'相互作用稳定剂结构域(5'isd)。
5、在一个实施方案中，所述esnrna包含靶向目的rna的靶向序列(ts)(或间隔子)。在另一个实施方案中，所述目的靶rna是微卫星重复rna或非重复rna。在另一个实施方案中，所述目的微卫星重复rna选自cug、cag、ggggcc和ccccgg。在一个实施方案中，所述esnrna包含靶向两个目的靶rna(ggggcc和ccccgg)的靶向序列(ts)。在另一个实施方案中，所述两个目的靶rna是微卫星重复rna和非重复rna。在另一个实施方案中，所述非重复rna是微卫星重复rna的侧翼序列。在另一个实施方案中，所述esnrna包含靶向两个或更多个目的rna的靶向序列(ts)。在另一个实施方案中，所述esnrna包含靶向两个或更多个目的rna的两个或更多个靶向序列(ts)。在另一个实施方案中，所述esnrna包含两个或更多个ts的融合物。
6、在一个实施方案中，所述esnrna包含sm结合结构域(smbd)。在一个实施方案中，所述smbd选自u1、u2、u4和u5 snrna。在另一个实施方案中，所述smbd源自假snrna。
7、在一个实施方案中，所述esnrna可操作地连接至snrna启动子。在另一个实施方案中，所述snrna启动子是u7启动子。在另一个实施方案中，所述u7启动子是内源u7启动子。在另一个实施方案中，所述u7启动子是人u7启动子(hu7)或小鼠u7启动子(mu7)。在另一个实施方案中，所述u7启动子是seq id no:43的内源人u7启动子。在一个实施方案中，所述snrna启动子是u1启动子。在另一个实施方案中，所述u1启动子是人u1启动子或小鼠u1启动子。在另一个实施方案中，所述snrna启动子选自：人u7启动子、人u1启动子、人u2启动子、人u4启动子、人u5启动子、人u6启动子、人7sk启动子、trna(val)启动子、小鼠u1启动子和小鼠u7启动子。在另一个实施方案中，所述载体包含一个或多个esnrna，或由一种或多种snrna启动子驱动的esnrna的一个或多个拷贝。在一个实施方案中，所述载体包含所述esnrna的两个拷贝(2x)。在一个实施方案中，所述载体包含两种snrna启动子，其中每种启动子驱动2x esnrna的拷贝。在另一个实施方案中，所述两种snrna启动子是u7启动子和u1启动子。在另一个实施方案中，所述两种snrna启动子选自：人u7启动子、人u1启动子、人u2启动子、人u4启动子、人u5启动子、人u6启动子、人7sk启动子、trna(val)启动子、小鼠u1启动子、小鼠u2启动子、小鼠u5启动子、小鼠u6启动子、小鼠u7启动子和小鼠h1启动子。在另一个实施方案中，所述两种snrna启动子是小鼠u7启动子和小鼠u1启动子。
8、在一个实施方案中，所述esnrna可操作地连接至snrna下游终止子(dt)。在另一个实施方案中，所述snrna dt是u7 dt。
9、在一个实施方案中，所述esnrna包含所述esl、所述u7启动子、所述ts、所述smbd、所述5'isd和所述dt。在另一个实施方案中，所述esnrna包含所述esl、所述u7启动子、所述u1启动子、所述ts、所述smbd、所述5'isd和所述dt。
10、
11、在一个实施方案中，所述esnrna包含所述esl、所述u7启动子、所述ts、所述smbd、所述5'isd和所述dt。在另一个实施方案中，所述esnrna包含所述esl、所述u7启动子、所述u1启动子、所述ts、所述smbd、所述5'isd和所述dt。
12、本文还公开了包含所述esnrna的载体。在一些实施方案中，所述载体包含所述esnrna的多个拷贝。在一些实施方案中，所述esnrna的多个拷贝是所述esnrna的2、3或4个拷贝(2x、3x或4x)。在一些实施方案中，所述esnrna的多个拷贝是所述esnrna的4个或更多个拷贝(4x或更多)。在一些实施方案中，所述esnrna的多个拷贝中的每个esnrna被源自snrna下游的人非编码基因组序列的核酸缓冲序列隔开。在一个实施方案中，所述缓冲序列源自u7下游的人基因组序列。在一个实施方案中，所述缓冲序列选自：缓冲物1(30bp、100bp或500bp)、缓冲物2(30bp、100bp或500bp)、缓冲物3(30bp、100bp或500bp)及其组合。在一个实施方案中，所述载体是病毒载体或非病毒载体。在另一个实施方案中，所述病毒载体是aav载体。在另一个实施方案中，所述aav载体是scaav载体或ssaav载体。在另一个实施方案中，所述aav载体是aav9载体。在另一个实施方案中，所述aav9载体是ssaav9载体或scaav9载体。
13、本文还公开了一种靶向一个或多个目的靶rna，并且对所述一个或多个靶rna进行阻断、敲低、编辑、外显子跳跃、外显子包含或剪接的方法，所述方法包括使本公开文本的esnrna与包含所述一个或多个靶rna的细胞接触。
14、本公开文本提供了一种靶向rna的核酸分子，所述靶向rna的核酸分子包含工程化snrna esnrna，其中所述esnrna系统包含工程化茎环(esl)，所述工程化茎环包含一个或多个选自以下的核酸序列：seq id no:1-seq id no:11、seq id no:146-seq id no:148、seqid no:163或seq id no:186-205。
15、在一些实施方案中，所述esnrna包含靶向目的靶rna的靶向序列(ts)。
16、在一些实施方案中，所述靶rna是前mrna或mrna序列。在一些实施方案中，所述目的靶rna是微卫星重复rna。在一些实施方案中，所述微卫星重复rna选自cug、cag和ggggcc+ccccgg。
17、在一些实施方案中，所述靶rna是编码dmd的序列。在一些实施方案中，所述靶向序列选自seq id no:206或seq id no:207。在一些实施方案中，所述靶向序列包含seq idno:208-seq id no:227中所示的一个或多个核酸序列。
18、在一些实施方案中，所述esnrna包含靶向两个目的rna的两个靶向序列。在一些实施方案中，所述两个ts是融合序列。
19、在一些实施方案中，所述esnrna包含选自以下的sm结合结构域(smbd)：u1、u2、u4和u5 smbd。
20、在一些实施方案中，所述smbd包含seq id no:31-seq id no:38或seq id no:164中任一个所示的核酸序列。
21、在一些实施方案中，所述esnrna包含5'相互作用稳定剂结构域(5'isd)，所述5'相互作用稳定结构域包含选自seq id no:12-seq id no:23中的任一个的核苷酸序列。
22、在一些实施方案中，所述esnrna包含seq id no:65-seq id no:119或seq id no:179-seq id no:185中任一个所示的核酸序列。
23、本公开文本提供了一种载体，所述载体包含本公开文本的一个或多个esnrna。在一些实施方案中，所述病毒载体是aav载体。在一些实施方案中，所述esnrna可操作地连接至启动子。
24、在一些实施方案中，所述esnrna可操作地连接至u7启动子或u1启动子。
25、在一些实施方案中，所述esnrna可操作地连接至下游终止子(dt)。在一些实施方案中，所述esnrna可操作地连接至u7下游终止子或u1下游终止子。
26、在一些实施方案中，所述载体包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或至少五个esnrna。在一些实施方案中，所述至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或至少五个esnrna各自靶向相同的靶rna序列。
27、在一些实施方案中，所述至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或至少五个esnrna靶向两个或更多个靶rna序列。在一些实施方案中，每个esnrna被缓冲序列隔开。在一些实施方案中，所述缓冲序列包含seq id no:24-seq id no:30中任一个所示的核酸序列。
28、在一些实施方案中，所述载体包含seq id no:123-seq id no:143、seq id no:168-seq id no:178或seq id no:231-seq id no:233中任一个所示的核酸序列。
29、一种靶向dmd外显子51rna的核酸分子，所述靶向dmd外显子51rna的核酸分子包含seq id no:206-seq id no:230中任一个所示的间隔子序列。
30、本公开文本提供了一种治疗受试者的疾病或障碍的方法，所述方法包括施用本公开文本的靶向rna的核酸分子或本公开文本的aav载体。
31、在一些实施方案中，所述疾病或障碍与毒性重复rna序列相关。在一些实施方案中，所述毒性重复rna序列是cag、cug、ggcccc、ccggg或ggccc+ccgggg rna重复。
32、在一些实施方案中，所述疾病或障碍是强直性肌营养不良(dm1)或亨廷顿病(hd)。
33、在一些实施方案中，所述疾病或障碍是迪谢内肌营养不良。在一些实施方案中，所述靶向rna的核酸分子或aav载体靶向编码抗肌萎缩蛋白(dmd)的rna序列。
34、在一些实施方案中，所述编码dmd的rna序列包含内含子序列或外显子序列。在一些实施方案中，所述外显子序列包含dmd的外显子51或其侧翼区域。在一些实施方案中，所述施用是静脉内、肌肉内、软膜下、鞘内、实质内、鞘内、纹状体内、皮下、皮内、腹膜内、瘤内、静脉内、眼内和/或肠胃外施用。
1.一种靶向rna的核酸分子，所述靶向rna的核酸分子包含工程化snrna esnrna，其中所述esnrna系统包含工程化茎环(esl)，所述工程化茎环包含一个或多个选自以下的核酸序列：seq id no:1-seq id no:11、seq id no:146-seq id no:148、seq id no:163或seqid no:186-205。
2.根据权利要求1所述的靶向rna的核酸分子，其中所述esnrna包含靶向目的靶rna的靶向序列(ts)。
3.根据权利要求2所述的靶向rna的核酸分子，其中所述靶rna是前mrna或mrna序列。
4.根据权利要求2所述的靶向rna的核酸分子，其中所述目的靶rna是微卫星重复rna。
5.根据权利要求4所述的靶向rna的核酸分子，其中所述微卫星重复rna选自cug、cag和ggggcc+ccccgg。
6.根据权利要求2所述的靶向rna的核酸分子，其中所述靶rna是编码dmd的序列。
7.根据权利要求6所述的靶向rna的核酸分子，其中所述靶向序列选自seq id no:206或seq id no:207。
8.根据权利要求6所述的靶向rna的核酸分子，其中所述靶向序列包含seq id no:208-seq id no:227中所示的一个或多个核酸序列。
9.根据权利要求1所述的靶向rna的核酸分子，其中所述esnrna包含靶向两个目的rna的两个靶向序列。
10.根据权利要求9所述的靶向rna的核酸分子，其中所述两个ts是融合序列。
11.根据权利要求1所述的靶向rna的核酸分子，其中所述esnrna包含选自以下的sm结合结构域(smbd)：u1、u2、u4和u5 smbd。
12.根据权利要求11所述的靶向rna的核酸分子，其中所述smbd包含seq id no:31-seqid no:38或seq id no:164中任一个所示的核酸序列。
13.根据权利要求1所述的靶向rna的核酸分子，其中所述esnrna包含5'相互作用稳定剂结构域(5'isd)，所述5'相互作用稳定剂结构域包含选自seq id no:12-seq id no:23中的任一个的核苷酸序列。
14.根据权利要求1所述的靶向rna的核酸，其中所述esnrna包含seq id no:65-seq idno:119或seq id no:179-seq id no:185中任一个所示的核酸序列。
15.一种载体，所述载体包含一个或多个权利要求1的esnrna。
16.根据权利要求15所述的载体，其中所述病毒载体是aav载体。
17.根据权利要求16所述的aav载体，其中所述snrna可操作地连接至启动子。
18.根据权利要求16所述的aav载体，其中所述snrna可操作地连接至u7启动子或u1启动子。
19.根据权利要求6所述的aav载体，其中所述snrna可操作地连接至下游终止子(dt)。
20.根据权利要求16所述的aav载体，其中所述snrna可操作地连接至u7下游终止子或u1下游终止子。
21.根据权利要求16所述的aav载体，其中所述载体包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或至少五个esnrna。
22.根据权利要求21所述的aav载体，其中所述至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或至少五个esnrna各自靶向相同的靶rna序列。
23.根据权利要求21所述的aav载体，其中所述至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或至少五个esnrna靶向两个或更多个靶rna序列。
24.根据权利要求21所述的aav载体，其中每个esnrna被缓冲序列隔开。
25.根据权利要求24所述的aav载体，其中所述缓冲序列包含seq id no:24-seq idno:30中任一个所示的核酸序列。
26.根据权利要求20所述的aav载体，其中所述载体包含seq id no:123-seq id no:143、seq id no:168-seq id no:178或seq id no:231-seq id no:233中任一个所示的核酸序列。
27.一种靶向一个或多个目的靶rna，并且对所述一个或多个靶rna进行阻断、敲低、编辑、外显子跳跃或剪接的方法，所述方法包括使权利要求1的esnrna与包含所述一个或多个靶rna的细胞接触。
28.一种靶向dmd外显子51rna的核酸分子，所述靶向dmd外显子51rna的核酸分子包含seq id no:206-seq id no:230中任一个所示的间隔子序列。
29.一种治疗受试者的疾病或障碍的方法，所述方法包括施用根据权利要求1所述的靶向rna的核酸分子或根据权利要求15所述的aav载体。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述疾病或障碍与毒性重复rna序列相关。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述毒性重复rna序列是cag、cug、ggcccc、ccggg或ggccc+ccgggg rna重复。
32.根据权利要求29所述的方法，其中所述疾病或障碍是强直性肌营养不良(dm1)或亨廷顿病(hd)。
33.根据权利要求29所述的方法，其中所述疾病或障碍是迪谢内肌营养不良。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述靶向rna的核酸分子或aav载体靶向编码抗肌萎缩蛋白(dmd)的rna序列。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述编码dmd的rna序列包含内含子序列或外显子序列。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述外显子序列包含dmd的外显子51或其侧翼区域。
37.根据权利要求29所述的方法，其中所述施用是静脉内、肌肉内、软膜下、鞘内、实质内、鞘内、纹状体内、皮下、皮内、腹膜内、瘤内、静脉内、眼内和/或肠胃外施用。
