本发明涉及经修饰的dda解旋酶，其可用于控制分析物诸如多核苷酸的移动。经修饰的dda解旋酶用于分析物检测和表征。本发明还涉及新颖的蛋白孔或孔复合体及其在分析物检测和表征中的用途。
背景技术：
1、使用纳米孔感测进行分析物(尤其是聚合物)表征的基本组分中的两者是(1)控制聚合物移动通过孔，以及(2)在聚合物移动通过孔时区分组成构建块。在纳米孔感测期间，相对于作为分析物相对于纳米孔移动的函数的测量信号的变化，孔的最窄部分通常对应于纳米孔的最具辨别力的部分。csgg被鉴定为来自大肠杆菌的非门控、非选择性蛋白质分泌通道(goyal等人,2014)，并已被用作检测和表征分析物的纳米孔。还公开了在这种情况下改善孔的特性的野生型csgg孔的突变(wo2016/034591、wo2017/149316、wo2017/149317、wo2017/149318、wo2018/211241和wo2019/002893，其通过引用以其整体并入本文)。wo2015/055981、wo2015/166276和wo2016/055777描述了多核苷酸结合蛋白，特别是dda解旋酶，其可用于控制分析物相对于跨膜蛋白孔(诸如本文描述的csgg孔)的移动，这些文献也通过引用以其整体并入本文。
技术实现思路
1、发明人惊奇地鉴定了特定的dda突变体，其具有改进的控制分析物通过孔的移动的能力。当使用孔对多核苷酸进行测序时，系统共同估计穿过孔的碱基/核苷酸的数量和身份。更好地控制移动速度的可变性可以减少统计噪声的来源中的一者并简化估计任务。多核苷酸在孔中连续短暂停留的运行可能会引发调用底层核苷酸/碱基的失败，从而导致缺失错误。异常长时间的停留可能会导致插入错误。确保每个核苷酸/碱基在孔中度过足够的时间间隔有助于解决来自噪声信号水平的核苷酸/碱基身份的统计不确定性。进一步的信息可以从停留时间对核苷酸/碱基身份的依赖性中提取，例如经由与运动酶的相互作用。减少停留时间的总体可变性有助于通过该通道提取更精确的信息。在信号水平提供关于移动的有限信息的区域(例如，长均聚物区域)，多核苷酸/碱基停留时间可用于推断穿过孔的碱基的数量。减少停留时间的可变性可以使这些推断更加精确。
2、在一些实施例中，当用于控制分析物通过跨膜孔的移动的方法和用于使用跨膜孔表征分析物的方法时，本发明的突变体表现出改进的准确性。在分析物表征(特别是多核苷酸)的情况下，准确性被解释为意指原始读数单工准确性；即单个分子通过跨膜孔的单次通过。准确性是跟踪测序装置的平台改进的有用测量。准确性还可以指共识准确性或检测特定事物(例如，诸如多核苷酸分析物中的突变)的准确性。另外地或替代性地，准确性被解释为意指高于特定置信水平的碱基的百分比，其中置信水平已经被预先校准。在一些实施例中，本发明的突变体显示出改进的准确性，而速度变化极小或甚至没有变化。在一些实施例中，准确性被提高以给出小于10％的误差、小于5％的误差、小于4％的误差、小于3％的误差、小于2％的误差、小于1％的误差、小于0.1％的误差。本发明人鉴定的突变体通常包括突变的组合，即突变体中与跨膜孔相互作用的部分中的一个或多个修饰。准确性还可能受到聚合物在酶控制下使孔易位的速度的影响，并且可以通过改变提供给酶的atp的浓度来改变该速度。发明人惊奇地认识到，在相同条件下的同一测序运行中的连续聚合物易位期间，酶可以表现出速度的变化，这可能导致准确性的降低。
3、准确性可能受到许多因素的影响，诸如纳米孔的形状和组成、酶以及酶与纳米孔之间的相互作用。它还受到酶控制下聚合物使孔易位的速度的影响，并且可以通过改变提供给酶的atp的浓度来增加或降低易位速度。发明人惊奇地认识到，在相同测序条件下的同一测序运行中的连续聚合物易位期间发生速度变化，这可能导致测序准确性的降低。可以测量多种聚合物的测序速度的变化以获得归一化的速度分布，并且发明人惊奇地认识到一些经修饰的酶可以产生较低的归一化速度分布并因此提高测序准确性。
4、本发明提供了：
5、-一种经修饰的dna依赖性atp酶(dda)解旋酶，其中该解旋酶在对应于dda 1993中的氨基酸位置55、114、156、177、210、221、350和358的一个或多个位置处包含修饰或取代；
6、-一种构建体，其包含本发明的解旋酶和另外的多核苷酸结合部分，其中解旋酶附接至多核苷酸结合部分，并且该构建体具有控制分析物的移动的能力；
7、-一种多核苷酸，其包含编码本发明的解旋酶或本发明的构建体的序列；
8、-一种载体，该载体包含本发明的多核苷酸，其可操作地连接至启动子；
9、-一种宿主细胞，其包含本发明的载体；
10、-一种制备本发明的解旋酶或本发明的构建体的方法，该方法包括：表达本发明的多核苷酸，用本发明的载体转染细胞，或培养本发明的宿主细胞；
11、-一种控制分析物的移动的方法，该方法包括使分析物与本发明的解旋酶或本发明的构建体接触，并由此控制分析物的移动；
12、-一种表征目标分析物的方法，该方法包括：
13、(a)使目标分析物与跨膜孔和本发明的解旋酶或本发明的构建体接触，使得解旋酶或构建体控制目标分析物通过孔的移动；以及
14、(b)当多核苷酸相对于孔移动时进行一次或多次测量，其中测量指示目标分析物的一种或多种特征并由此表征目标分析物；
15、-一种形成用于表征目标分析物的传感器的方法，该方法包括在(a)孔与(b)本发明的解旋酶或本发明的构建体之间形成复合体，并由此形成用于表征目标分析物的传感器；
16、-一种用于表征目标分析物的传感器，该传感器包括(a)孔与(b)本发明的解旋酶或本发明的构建体之间的复合体；
17、-本发明的解旋酶或本发明的构建体用于控制目标分析物通过孔的移动的用途；
18、-一种用于表征目标分析物的试剂盒，该试剂盒包括
19、(a)孔以及本发明的解旋酶或本发明的构建体；或者
20、(b)本发明的解旋酶或本发明的构建体以及一个或多个负载部分；
21、-一种用于表征样品中的目标分析物的设备，其包括(a)多个孔以及(b)多种本发明的解旋酶或多个本发明的构建体；
22、-一种产生本发明的解旋酶的方法，该方法包括：
23、(a)提供解旋酶；以及
24、(b)修饰解旋酶以产生本发明的解旋酶；
25、-一种产生本发明的构建体的方法，该方法包括将本发明的解旋酶附接至另外的多核苷酸结合部分，并由此产生构建体；
26、-一系列附接至多核苷酸的两种或更多种解旋酶，其中两种或更多种解旋酶中的至少一种是本发明的解旋酶；以及
27、-一种当目标分析物相对于跨膜孔的移动由dna依赖性atp酶(dda)解旋酶控制时改善移动的方法，其中dna依赖性atp酶(dda)解旋酶被修饰以在对应于dda1993中的氨基酸位置55、114、156、177、210、221、350和358的一个或多个位置处和/或对应于dda 1993中的氨基酸位置40处包含取代，其改善目标分析物相对于跨膜孔的移动。
28、本发明人还惊奇地鉴定了新的跨膜孔突变，其改善或改变分析物穿过/相对于其的速度，优选地其中分析物的移动在多核苷酸结合蛋白的控制下。在本发明的一个实施例中，跨膜孔突变增加了分析物穿过/相对于其的速度。在另一实施例中，跨膜孔突变降低了分析物穿过/相对于其的速度。相对于分析物相对于不包含本发明的突变的孔移动的速度而言，分析物穿过/相对于孔的速度可以增加5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、100％、150％、200％或300％或更大。相对于分析物相对于不包含本发明的突变的孔移动的速度而言，分析物穿过/相对于孔的速度可以降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％。本发明人惊奇地发现，由对孔的修饰引起的速度的这些改变，诸如速度的增加或降低，对准确性读数具有最小的影响或没有影响。这在表征分析物的方法中是特别有利的，其中分析物与孔和多核苷酸结合蛋白(诸如本发明的解旋酶)接触，使得多核苷酸结合蛋白控制目标分析物通过/相对于孔的移动。在一个实施例中，突变型孔以与不包含突变的其他跨膜孔不同的方式与多核苷酸结合蛋白相互作用。孔突变体可以改变dna通过孔易位的速度分布，使得与不包含突变的其他跨膜孔相比，速度分布更紧密，导致测序错误减少。在本发明的优选实施例中，本发明的经修饰的dna依赖性atp酶(dda)解旋酶用于控制分析物(诸如多核苷酸)通过本发明的跨膜孔的移动。
29、本发明提供了一种分离的csgg孔或其同源物或突变体，或一种包含csgg孔或其同源物或突变体和经修饰的csgf肽或其同源物或突变体的分离的孔复合体，其中csgg孔包含至少一种单体，该单体包含在seq id no:117中的位置w97、q100、e101、n102和t104中的一个或多个处的修饰；
30、在一个方面，csgf肽包含csgg结合区域和在孔中形成收缩结构(constriction)的区域。在一个方面，csgf肽是缺少csgf的c-末端头结构域的截短的csgf肽。在另一方面，csgf肽是缺少csgf的c-末端头和颈结构域的一部分的截短的csgf肽。在另一方面，csgf肽是缺少csgf的c-末端头和颈结构域的截短的csgf肽。csgg/csgf孔在本文中也称为孔复合体和分离的孔复合体。分离的孔复合体包含csgg孔或其同源物或突变体，以及经修饰的csgf肽或其同源物或突变体，特别是截短的csgf片段或其同源物或突变体。在一个实施例中，所述经修饰的csgf肽、或其同源物或突变体位于csgg孔、或其同源物或突变体的内腔中。在另一实施例中，所述分离的孔复合体具有两个或更多个通道收缩结构，一个由通过其收缩结构环形成的csgg孔定位或提供，并且另一个另外的通道收缩结构或读取头(readerhead)，由经修饰的csgf肽或其同源物或突变体引入。在一个实施例中，所述csgg孔或csgg样孔不是野生型孔，而是突变型csgg孔，在特定实施例中，突变存在于例如所述通道收缩结构环中。在其他实施例中，突变替代性地或另外地存在于孔的顶部、孔与多核苷酸结合蛋白相互作用的区域处。突变可以影响多核苷酸结合蛋白如何与孔相互作用和/或孔如何与多核苷酸结合蛋白相互作用。在另一实施例中，包含经修饰的csgf肽或其同源物或突变体的分离的孔复合体具有直径在0.5nm至2.0nm范围内的csgf通道收缩结构。在一个实施例中，孔复合体包括：(i)csgg孔，其包含第一开口、包括β桶的中间区段、第二开口、以及从第一开口穿过中间区段延伸至第二开口的内腔，其中中间区段的内腔表面限定csgg收缩结构；以及(ii)多个经修饰的csgf肽，其各自具有csgf收缩结构区域和csgf结合区域(本文也称为csgg结合结构域或csgf的区域)，其中经修饰的csgf肽在csgg孔的β桶内形成csgf收缩结构，并且其中csgg收缩结构和csgf收缩结构在csgg孔的β桶内同轴间隔开。csgg孔的内腔表面可以包含限定csgg收缩结构的csgg单体的一个或多个环区域。csgf收缩结构区域和csgf结合区域通常对应于csgf成熟肽的n-末端部分。在一个实施例中，孔复合体不包括csga、csgb和csge。
31、一个实施例涉及一种包含csgg孔和经修饰的csgf肽的孔，其中经修饰的csgf肽与csgg结合并在孔中形成收缩结构，并且其中孔发生突变以改变孔与多核苷酸结合酶的相互作用和/或所述孔发生突变以提高分析物穿过孔的速度。在本发明的一个实施例中，分析物穿过孔的速度增加。在本发明的另一实施例中，分析物穿过孔的速度降低。
32、另一实施例涉及分离的孔复合体，其中经修饰的csgf肽和csgg孔或所述孔的单体、或其同源物或突变体共价偶联。并且甚至更具体地，所述偶联经由半胱氨酸残基或经由csgg单体中对应于seq id no:117或seq id no:3的132、133、136、138、140、142、144、145、147、149、151、153、155、183、185、187、189、191、201、203、205、207或209的位置处的非天然反应性或光反应性氨基酸或其同源物进行。
33、本发明还提供了一种分离的跨膜孔或孔复合体，或一种膜组合物，其包含本发明的分离的孔或孔复合体，以及膜的组分。特别地，所述跨膜孔或孔复合体或膜组合物由本发明的分离的孔或孔复合体以及膜的组分或绝缘层组成。
34、本发明还提供了：
35、-一种膜，其包含本发明的孔或孔复合体；
36、-一种阵列，其包含多个本发明的膜；
37、-一种系统，其包括(a)本发明的膜或本发明的阵列，(b)用于跨膜施加电势的装置，
38、以及(c)用于检测跨膜的电信号或光信号的装置。
39、本发明还提供了一种用于产生本发明的跨膜孔复合体的方法，该方法包括在适当的宿主细胞中共表达csgg孔或其同源物或突变体，以及经修饰的csgf肽或其同源物或突变体，从而允许体内与跨膜孔复合体形成。
40、本发明还提供了一种用于产生本发明的分离的孔复合体的方法，该方法包括使csgg单体或其同源物或突变体与经修饰的csgf肽或其同源物或突变体接触，从而允许分离的孔复合体的体外重建。经修饰的csgf肽可以是在氨基酸序列中的合适位置处包含酶切割位点的肽，其在孔形成之前或之后被切割。
41、在具体的实施例中，所述经修饰的csgf肽或其同源物或突变体包含seq id no:12或seq id no:14，或其同源物或突变体。在特定实施例中，所述方法的经修饰的csgf肽包含seq id no:15或seq id no:16，或其同源物或突变体。
42、本发明还提供了一种用于确定目标分析物的存在、不存在或一种或多种特征的方法，该方法包括以下步骤：
43、(i)使目标分析物与本发明的分离的孔或分离的孔复合体或本发明的跨膜孔复合体接触，使得目标分析物移动到孔通道中；以及
44、(ii)当分析物移动通过孔通道时进行一次或多次测量，并由此确定分析物的存在、不存在或一种或多种特征。在一个实施例中，所述分析物是多核苷酸。特别地，所述使用多核苷酸作为分析物的方法替代性地包括确定选自以下的一种或多种特征：(i)分析物或多核苷酸的长度，(ii)分析物或多核苷酸的身份，(iii)分析物或多核苷酸的序列，(iv)分析物或多核苷酸的二级结构以及(v)分析物或多核苷酸是否被修饰。
45、在另一实施例中，分析物是蛋白质、(多)肽或肽。在进一步的实施例中，所述分析物是聚合物、寡糖、多糖或小的有机或无机化合物，诸如例如但不限于药理学活性化合物、有毒化合物和污染物。
46、本发明还提供了一种使用本发明的分离的孔或分离的孔复合体或本发明的跨膜孔复合体表征多核苷酸或(多)肽的方法。特别地，所述csgg孔或其同源物或突变体包含形成csgg孔通道的六至十个csgg单体。
47、本发明还提供了本发明的分离的孔或分离的孔复合体或本发明的跨膜孔复合体用于确定目标分析物的存在、不存在或一种或多种特征的用途。此外，本发明还涉及一种用于表征目标分析物的试剂盒，其包括(a)所述分离的孔或孔复合体和(b)膜的组分。
48、本发明还提供了：
49、-一种改变目标分析物穿过孔的速度的方法，该方法包括使目标分析物与本发明的分离的孔或分离的孔复合体或与本发明的跨膜孔复合体接触，使得目标分析物相对于孔复合体移动或移动到孔复合体中；
50、-一种用于表征目标分析物的试剂盒，其包括(a)本发明的分离的孔或分离的孔复合体，以及(b)膜的组分和(c)多核苷酸结合蛋白中的一者或两者；
51、-一种表征目标分析物的方法，该方法包括：
52、(a)使目标分析物与本发明的分离的孔或分离的孔复合体以及本发明的dna依赖性atp酶(dda)解旋酶或本发明的解旋酶构建体接触，使得解旋酶或构建体控制目标分析物通过孔或孔复合体的移动；以及
53、(b)当多核苷酸相对于孔或孔复合体移动时进行一次或多次测量，其中测量指示目标分析物的一种或多种特征并由此表征目标分析物；
54、-一种用于表征目标分析物的试剂盒，其包括(a)本发明的dna依赖性atp酶(dda)解旋酶或本发明的解旋酶构建体(b)本发明的分离的csgg孔或分离的孔复合体；
55、-一种设备，其包括插入体外膜中的本发明的孔或孔复合体；
56、-一种设备，其通过包括以下的方法来生产：(i)获得本发明的分离的孔或分离的孔复合体，以及(ii)使分离的孔或分离的孔复合体与体外膜接触，使得孔插入体外膜中。
1.一种经修饰的dna依赖性atp酶(dda)解旋酶，其中所述解旋酶在对应于dda1993中的氨基酸位置55、114、156、177、210、221、350和358的位置中的一个或多个处包含修饰或取代。
2.根据权利要求1所述的经修饰的dna依赖性atp酶(dda)解旋酶，其中(a)对应于位置55的氨基酸被d、e、k、n或s取代，(b)对应于位置114的氨基酸被a、v、i、l、m、f、y、w、g、p、s、t、n或q取代，(c)对应于位置156的氨基酸被a、e、f、g、i、l、m、p、s、v、y、d、k或n取代，(d)对应于位置177的氨基酸被d、e、f、g、h、i、l、m、n、q、r、s、t、v、w或y取代，(e)对应于位置210的氨基酸被d、e、k、s、n、r、h或y取代，(f)位置221处的氨基酸被d、k、e、q、r、a、h、l、t或y取代，(g)对应于位置350的氨基酸被a、d、e、g、k、l、n、q、r、t、v、h或m取代，或被d、e、a、v、i、l、m、f、w、r、h、k、l、s、t、n或q取代，以及/或者(h)对应于位置358的氨基酸被d、e、a、v、i、l、m、f、y、w、r、h、l、s、t、n或q取代。
3.根据权利要求1或2所述的经修饰的dda解旋酶，其中所述解旋酶在对应于dda1993中的氨基酸位置40的位置处进一步包含修饰或取代。
4.根据权利要求3所述的经修饰的dna依赖性atp酶(dda)解旋酶，其中对应于位置40的氨基酸被a、v、i、l、m、f、y或w取代。
5.一种构建体，其包含根据权利要求1至4中任一项所述的解旋酶和另外的多核苷酸结合部分，其中所述解旋酶附接至所述多核苷酸结合部分，并且所述构建体具有控制分析物的移动的能力。
6.根据权利要求5所述的构建体，其中所述构建体包含两种或更多种根据权利要求1至4中任一项所述的解旋酶。
7.一种多核苷酸，其包含编码根据权利要求1至4中任一项所述的解旋酶或根据权利要求5或6所述的构建体的序列。
8.一种载体，所述载体包含根据权利要求7所述的多核苷酸，其可操作地连接至启动子。
9.一种宿主细胞，其包含根据权利要求8所述的载体。
10.一种制备根据权利要求1至4中任一项所述的解旋酶或根据权利要求5或6所述的构建体的方法，所述方法包括：表达根据权利要求7所述的多核苷酸，用根据权利要求8所述的载体转染细胞，或培养根据权利要求9所述的宿主细胞。
11.一种控制分析物的移动的方法，所述方法包括使所述分析物与根据权利要求1至4中任一项所述的解旋酶或根据权利要求5或6所述的构建体接触，并由此控制所述分析物的所述移动。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法用于控制分析物通过跨膜孔的所述移动。
13.一种表征目标分析物的方法，所述方法包括：
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述一个或多个特征选自(i)所述目标分析物的长度，(ii)所述目标分析物的身份，(iii)所述目标分析物的序列，(iv)所述目标分析物的二级结构以及(v)所述目标分析物是否被修饰。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述目标分析物通过甲基化、氧化、损伤、用一种或多种蛋白质、或用一种或多种标记、标签或间隔基进行修饰。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中通过电测量和/或光学测量来测量所述目标分析物的所述一个或多个特征。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述电测量是电流测量、阻抗测量、隧穿测量或场效应晶体管(fet)测量。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述方法包括：
19.根据权利要求13至18中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括跨所述孔施加电压以在所述孔与所述解旋酶或构建体之间形成复合体的步骤。
20.根据权利要求13至20中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸的至少一部分是双链的。
21.根据权利要求13至20中任一项所述的方法，其中所述孔是跨膜蛋白孔或固态孔。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述跨膜蛋白孔源自溶血素、杀白细胞素、耻垢分枝杆菌孔蛋白a(mspa)、mspb、mspc、mspd、胞溶素、外膜孔蛋白f(ompf)、外膜孔蛋白g(ompg)、外膜磷脂酶a、奈瑟菌自转运脂蛋白(nalp)和wza、csgg、csgg/csgf、胞溶素、clya、sp1或溶血蛋白fragaceatoxin c(frac)。
23.根据权利要求22所述的方法，其中跨膜蛋白由六至十个如seq id no:3所示的相同亚基或(b)其变体形成，其中所述亚基中的一个或多个在整个序列上与seq id no:3具有至少40％同一性，并且其具有孔活性。
24.一种形成用于表征目标分析物的传感器的方法，所述方法包括在(a)孔与(b)根据权利要求1至4中任一项所述的解旋酶或根据权利要求5或6所述的构建体之间形成复合体，并由此形成用于表征所述目标分析物的传感器。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述复合体通过以下来形成：(a)在所述目标分析物存在下使所述孔与所述解旋酶或构建体接触，以及(a)跨所述孔施加电势。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述电势是电压电势或化学势。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述复合体是通过将所述孔共价附接至所述解旋酶或构建体而形成的。
28.一种用于表征目标分析物的传感器，所述传感器包含(a)孔与(b)根据权利要求1至4中任一项所述的解旋酶或根据权利要求5或6所述的构建体之间的复合体。
29.根据权利要求1至4中任一项所述的解旋酶或根据权利要求5或6所述的构建体用于控制目标分析物通过孔的移动的用途。
30.一种用于表征目标分析物的试剂盒，所述试剂盒包括
31.一种用于表征样品中的目标分析物的设备，所述设备包括(a)多个孔以及(b)多种根据权利要求1至4中任一项所述的解旋酶或多个根据权利要求5或6所述的构建体。
32.一种产生根据权利要求1至4中任一项所述的解旋酶的方法，所述方法包括：
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述方法进一步包括(c)确定所得解旋酶是否能够控制多核苷酸的移动。
34.一种产生根据权利要求5或6所述的构建体的方法，所述方法包括将根据权利要求1至4中任一项所述的解旋酶附接至另外的多核苷酸结合部分，并由此产生所述构建体。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述方法进一步包括确定所得构建体是否能够控制多核苷酸的移动。
36.一系列附接至多核苷酸的两种或更多种解旋酶，其中所述两种或更多种解旋酶中的至少一种是根据权利要求1至4中任一项所述的解旋酶。
37.一种当目标分析物相对于跨膜孔的移动由dna依赖性atp酶(dda)解旋酶控制时改善所述移动的方法，其中所述dna依赖性atp酶(dda)解旋酶被修饰以在对应于dda 1993中的氨基酸位置55、114、156、177、210、221、350和358的位置中的一个或多个处和/或对应于dda 1993中的氨基酸位置40的位置处包含取代，其改善所述目标分析物相对于所述跨膜孔的所述移动。
38.一种分离的csgg孔或其同源物或突变体，或一种包含csgg孔或其同源物或突变体和经修饰的csgf肽或其同源物或突变体的分离的孔复合体，其中所述csgg孔包含至少一种单体，所述单体包含在seq id no:117中的位置w97、q100、e101、n102和t104中的一个或多个处的修饰。
39.根据权利要求38所述的分离的孔复合体，其中所述经修饰的csgf肽或其同源物或突变体被插入到所述csgg孔或其同源物或突变体的内腔中。
40.根据权利要求38或39所述的分离的孔复合体，其中所述孔复合体具有两个或更多个通道收缩结构，包括csgg通道收缩结构和csgf通道收缩结构。
41.根据权利要求40所述的分离的孔复合体，其中所述csgf通道收缩结构具有在0.5nm至2.0nm范围内的直径。
42.一种分离的跨膜孔复合体，其包含根据权利要求38至41中任一项所述的孔或孔复合体以及膜的组分。
43.一种膜，其包含根据权利要求38至41中任一项所述的孔或孔复合体。
44.一种阵列，其包含多个根据权利要求43所述的膜。
45.一种系统，其包括(a)根据权利要求43所述的膜或根据权利要求44所述的阵列，(b)用于跨所述膜施加电势的装置，以及(c)用于检测跨所述膜的电信号或光信号的装置。
46.一种用于产生根据权利要求42所述的跨膜孔复合体的方法，所述方法包括在适当的宿主细胞中共表达所述csgg孔或其同源物或突变体，以及所述经修饰的csgf肽或其同源物或突变体，从而允许体内跨膜孔复合体形成。
47.一种用于产生根据权利要求38至41中任一项所述的分离的孔复合体的方法，所述方法包括使csgg单体或其同源物或突变体与所述经修饰的csgf肽或其同源物或突变体接触，从而允许所述分离的孔复合体的体外重建。
48.一种用于确定目标分析物的存在、不存在或一个或多个特征的方法，所述方法包括以下步骤：
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述目标分析物相对于所述孔复合体的所述移动由多核苷酸结合蛋白、根据权利要求1至4中任一项所述的dda解旋酶或根据权利要求5或6所述的构建体控制。
50.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述分析物是多核苷酸。
51.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述分析物是(多)肽。
52.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述分析物是多糖。
53.根据权利要求50所述的方法，其包括确定选自以下的一个或多个特征：(i)所述多核苷酸的长度，(ii)所述多核苷酸的身份，(iii)所述多核苷酸的序列，(iv)所述多核苷酸的二级结构以及(v)所述多核苷酸是否被修饰。
54.一种使用根据权利要求38至41中任一项所述的分离的孔或分离的孔复合体或根据权利要求42所述的跨膜孔复合体来表征多核苷酸或(多)肽的方法。
55.根据权利要求46至54中任一项所述的方法，其中所述csgg孔或其同源物或突变体包含六至十个单体。
56.根据权利要求38至41中任一项所述的分离的孔或分离的孔复合体或根据权利要求42所述的跨膜孔复合体用于确定目标分析物的存在、不存在或一个或多个特征的用途。
57.一种改变目标分析物穿过孔的速度的方法，所述方法包括使所述目标分析物与根据权利要求38至41中任一项所述的分离的孔或分离的孔复合体或与根据权利要求42所述的跨膜孔复合体接触，使得所述目标分析物相对于所述孔复合体移动或移动到所述孔复合体中。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述目标分析物相对于所述孔复合体的所述移动由根据权利要求1至4中任一项所述的dda解旋酶或根据权利要求5或6所述的构建体控制。
59.一种用于表征目标分析物的试剂盒，所述试剂盒包括(a)根据权利要求38至41中任一项所述的分离的孔或分离的孔复合体，以及(b)膜的组分和(c)多核苷酸结合蛋白中的一者或两者。
60.一种表征目标分析物的方法，所述方法包括：
61.一种用于表征目标分析物的试剂盒，所述试剂盒包括(a)根据权利要求1至4中任一项所述的dna依赖性atp酶(dda)解旋酶或根据权利要求5或6所述的解旋酶构建体，以及(b)根据权利要求38至41中任一项所述的分离的csgg孔或分离的孔复合体。
62.一种设备，其包括插入体外膜中的根据权利要求38至41中任一项所述的跨膜蛋白孔或孔复合体。
63.一种设备，其通过包括以下的方法来生产：(i)获得根据权利要求38至41中任一项所述的分离的孔或分离的孔复合体，以及(ii)使所述分离的孔或分离的孔复合体与体外膜接触，使得所述孔插入所述体外膜中。
